文獻名：Rapid and quantitative protein precipitation

for proteome analysis by mass spectrometry（快速定量的蛋白質沉澱方法用於質譜蛋白質組學分析）

期刊名：J. Proteome Res

發表時間：（2020年5月）

IF：3.534

單位：Department of Chemistry,Dalhousie University,Halifax,Nova Scotia,Canada

物種：釀酒酵母

技術：蛋白質沉澱方法

一、 概述：（用精煉的語言描述文章的整體思路及結果）

本研究選取釀酒酵母、通過不同條件的改變，優化了一套回收率較高、時間較短的蛋白沉澱方法。之後通過蛋白定量，凝膠電泳和LC-MS分析具體研究了分離到的蛋白質的數量和性質。文章中通過對鹽濃度，孵育溫度，丙酮含量及初始蛋白濃度的調節，具體優化構建一套回收率較高，產量較優，時間較短，提取較穩定的蛋白沉澱方法，即室溫下以80%的丙酮，100 mM NaCl，孵育2min，以獲得高回收率的蛋白沉澱。為後期蛋白質的質譜分析提供更優質的樣品蛋白質。

二、 研究背景：（簡要介紹研究進展動態、研究目的和意義）

在質譜分析前需要對蛋白進行提取純化，目前常用溶劑沉澱方法對蛋白質進行分離純化，多個研究表明丙酮對蛋白具有很好的沉澱作用，常用來純化組學分析前的蛋白質，但存在回收率低，不穩定等問題，需要對方法進行優化。其中的關鍵因素是溫度，丙酮濃度，孵育時間，鹽濃度以及提取蛋白的濃度及性質。本研究通過對這些條件的調節，根據蛋白回收率和回收時間的統計，在不考慮蛋白質分子量、親疏水性及等電點等因素下，優化了一套高回收率且沉澱時間較短的沉澱方法。

三、實驗設計：

四、研究成果：（重點圖表展示）

1、對提取的釀酒酵母採用80%丙酮，<1 mM NaCl 溶液，-20°過夜孵育來沉澱蛋白，回收率極低（3 ± 2%），然而當加入>10 mM NaCl溶液時,蛋白回收率達到98 ± 4%。同時，實驗發現，在離子強度足夠大的情況下，室溫中蛋白回收率也很高，達到99 ± 2%，如圖1A所示。圖2B展示了不同孵育時間下，NaCl溶液濃度對回收率的影響，可以看到當NaCl溶液達到一定濃度時，時間的增長並不會顯著增加蛋白回收率。圖1C是對沉澱後蛋白進行凝膠電泳，上部為不加NaCl鹽溶液沉澱的蛋白質，下部為加入20mM NaCl溶液沉澱的蛋白質，可以明顯看出NaCl鹽溶液對於蛋白質沉澱有顯著效果。

圖1

2、樣品的初始蛋白濃度也是影響沉澱蛋白回收的重要因素。圖2的實驗結果顯示，時間對於高濃度當酵母樣品的回收率沒有影響，對於低濃度蛋白來說，增長孵育（30分鐘）時間也能達到較高的回收率，所以優化的高鹽/室溫沉澱方法同樣適用於稀釋為0.01 g/ L的低濃度樣品。

圖2

3、對不同沉澱條件下得到的蛋白質進行質譜檢測，得到如圖3結果。圖3A和3B分別表示-20 °C和室溫下不同沉澱時間下鑑定的蛋白數量，發現主要鑑定到的蛋白質在24h孵育條件下沉澱到的，但2min孵育條件下能沉澱到鑑定蛋白的92%。同時圖3C顯示，室溫80%，100 mM NaCl孵育2min和-20°80%丙酮，100 mM NaCl孵育24h兩種沉澱方法所鑑定到的蛋白質有70%以上的重疊。圖3D顯示了兩種沉澱方法蛋白質PSM計數之間的強相關性，進一步說明兩種沉澱方法對蛋白質的回收效果相似。

圖3

4、此外對不同沉澱方法得到的蛋白質性質進行了分析，如圖4所示，兩種沉澱方法得到的蛋白質的分子量、等電點和GRAVY分數都無顯著性統計差異。

圖4

5、通過鑑定蛋白質PSM （肽段譜圖匹配）的計數，對蛋白質丰度進行量化，發現高丰度的蛋白質在上清液中被鑑定到的概率更高。如圖5所示。

圖5

五、文章亮點（結論討論）：

該研究優化了一套蛋白質高效沉澱方法，即在蛋白溶液中加入80%丙酮和高鹽溶液（100 mM NaCl），室溫孵育2min，經過多次離心，分別收集上清及沉澱，然後再離心後去掉溶液，風乾至顆粒。通過對沉澱蛋白進行定量，凝膠電泳以及質譜分析鑑定，證明了該套方法能夠高效分離完整的蛋白質，蛋白回收率高，重現性較好，是一種簡單、快速且經濟的方法，能廣泛應用於蛋白質組學、代謝組學和商業蛋白質加工等方面。

閱讀人：張霞