專案文章｜DNA(羥)甲基化研究揭示鐵離子依賴表觀調控促進狼瘡致病性T細胞分化｜易基因
易基因（羥）甲基化DNA免疫共沉澱測序（h）MeDIP-seq研究成果見刊《Journal of Clinical Investigation》
2022年5月2日，中南大學湘雅二醫院趙明教授團隊、中國醫學科學院面板病醫院陸前進教授團隊合作在Journal of Clinical Investigation上發表了題為“Iron-dependent epigenetic modulation promotes pathogenic T cell differentiation in lupus”的研究成果。該研究首次揭示鐵離子過載通過調節DNA去甲基化促進以濾泡輔助性T細胞（Follicular helper T cells，Tfh cells）為代表的致病性T細胞異常分化，從而加重自身免疫抗體產生及系統性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）發病，提示T細胞內鐵離子可能是治療SLE的新靶點。
標題：Iron-dependent epigenetic modulation promotes pathogenic T cell differentiation in lupus（鐵離子依賴的表觀遺傳調控促進了狼瘡致病性T細胞分化）
期刊：Journal of Clinical Investigation
影響因子: IF 14.808
發表時間：2022.05.02
技術平臺：RNA-seq、MeDIP-seq、hMeMIP-seq、hMeMIP-qPCR（易基因提供）
摘要：
微量元素鐵水平會影響免疫反應和疫苗接種，但鐵離子在自身免疫性疾病中的作用尚不清楚。致病性T細胞，尤其是濾泡輔助性T細胞（Tfh）的異常擴增在系統性紅斑狼瘡（SLE）的發病機制中起著重要的作用。本研究作者揭示了鐵在SLE致病性T細胞分化調控中的重要作用。鐵過載促進了狼瘡易感小鼠Tfh細胞擴增、促炎細胞因子分泌和自身抗體的產生。經高鐵飲食（high-iron diet,HID）處理的小鼠表現Tfh 細胞百分比增加和抗原特異性 GC 反應。補充鐵有助於Tfh 細胞分化，而鐵螯合則抑制Tfh細胞分化。研究結果證明miR-21/BDH2通路在Tfh細胞分化過程中促進鐵蓄積，並進一步促進Fe2+依賴性TET酶活性和BCL6基因去甲基化。因此，維持鐵穩態可能對消除致病性 Th 細胞至關重要，並可能有助於改善 SLE 患者的管理。
鐵過載對SLE致病性T細胞分化和發病機制的作用示意圖
背景：
系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種複雜的自身免疫性疾病，致病性T細胞的異常擴增在系統性紅斑狼瘡的發病中起到重要作用。特別是濾泡輔助性T細胞（Tfh cells）輔助B細胞活化分化為漿細胞，產生大量自身抗體。SLE患者體內T細胞異常活化分化的機制仍未闡明。鐵是體內一種重要的微量元素，參與包括DNA複製、ROS產生等許多生物學過程。鐵離子水平也會影響免疫反應和疫苗接種，但鐵離子在自身免疫性疾病中的作用尚不清楚。目前暫無相關研究報道鐵離子在Tfh細胞的分化中的調控作用。
方法：
患者招募
從門診面板科診所和住院病房招募193名SLE患者，根據狼瘡活動指數(SLEDAI)評分評估活動類別：無效（SLEDAI≤ 4），活躍（SLEDAI>4）。
Pristane誘導狼瘡小鼠模型的建立
為誘導狼瘡樣疾病，給12周齡雌性WT和miR-21 cKO小鼠腹腔注射500μL的Pristane（Sigma）。在Pristane刺激觀察期間每週檢測尿蛋白。處理3個月後處死小鼠用於分析。從DLN和脾臟分離細胞、收集血清、將腎組織用福爾馬林固定幷包埋在石蠟中。
RNA-seq
從WT和miR-21 cKO小鼠中分離脾原始CD4+T細胞，在Tfh極化條件下培養5天。從Tfh細胞中提取總RNA進行RNA-seq測序。
MeDIP-seq和hMeDIP-seq測序分析
從誘導的Tfh細胞中分離DNA,1µg起始基因組DNA片段平均大小為300bp。在深圳市易基因科技有限公司進行DNA甲基化免疫共沉澱測序（MeDIP-seq）和DNA羥甲基化免疫共沉澱測序（hMeDIP-seq）分析。
結果：
該研究首次揭示鐵離子過載通過調節DNA去甲基化促進以Tfh細胞為代表的致病性T細胞異常分化，從而加重自身免疫抗體產生及SLE發病，提示T細胞內鐵離子可能是治療SLE的新靶點。研究人員首先發現SLE患者CD4+T細胞中的Fe2+水平顯著升高，與Tfh細胞的百分比呈正相關。進一步通過高鐵飲食實驗證明提高鐵離子水平有利於小鼠體內Tfh細胞和GCB細胞擴增，增加CD4+T細胞炎症因子IFN-γ和IL-17A分泌，促進MRL/lpr狼瘡小鼠體內自身抗體產生，加重狼瘡小鼠疾病表型。補充鐵離子可以促進Tfh細胞體外誘導分化。相反，用2,5-二羥基苯甲酸和鐵螯合劑CPX可以減少細胞內的鐵離子蓄積，顯著抑制Tfh細胞分化。機制方面，研究揭示miR-21/BDH2通路在調控T細胞內鐵離子蓄積以及Tfh細胞分化中發揮重要作用。過表達miR-21或干擾BDH2表達，可以增強TET蛋白酶活性，導致Tfh細胞分化關鍵轉錄因子BCL6基因啟動子低甲基化，促進BCL6基因表達。
關鍵圖形：
作者通過甲基化DNA免疫沉澱（MeDIP）和羥甲基化DNA免疫沉澱-qPCR（hMeDIP-qPCR）來鑑定miR-21/BDH2對Tfh基因DNA甲基化/羥甲基化的影響。在Agomir-21或siRNA-BDH2細胞轉染中，顯示BCL6基因啟動子區域DNA羥甲基化水平增加和DNA甲基化水平減少，但與相應對照組相比，CXCR5、PDCD1、IL21啟動子區域未檢測到顯著差異。相反，通過Antagomir-21抑制miR-21表達或通過pCMV6-BDH2過表達BDH2降低了TET酶活性。BCL6基因啟動子中抑制miR-21或過表達BDH2的細胞表現出DNA羥甲基化水平減少和DNA甲基化水平增加。此外，PDCD1基因啟動子區域抑制miR-21細胞的DNA甲基化水平也增加。然而，CXCR5和IL21基因啟動子的DNA甲基化/羥甲基化沒有明顯差異。
圖：miR-21/BDH2通路通過調節細胞內鐵離子促進BCL6基因的DNA羥甲基化
在用Agomir-21或siRNA-BDH2轉染的Tfh細胞中使用MeDIP-Seq和hMeDIP-Seq驗證了BCL6啟動子區域的5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）分佈變化。
圖：BCL6基因的5mC MeDIP-seq和5hmC hMeDIPseq的代表性IGV分析
結論：
本研究表明，鐵離子過載是狼瘡自身免疫反應的重要誘導因素，並表明調節鐵穩態可能是SLE治療的良好靶點。本研究還為控制膳食鐵在SLE患者臨床管理中的重要性提供了實驗依據，為SLE治療提供了新潛在策略。
易基因小結：
該研究揭示了miR-21/BDH2/Fe2+調控SLE中Tfh細胞異常分化的新機制，擴充套件了對鐵在自身免疫性疾病和體液免疫中作用的認識。本研究對於患有缺鐵性貧血的SLE患者臨床補鐵治療也具有一定的指導意義。提示臨床上缺鐵性貧血的SLE患者補鐵時要注意監測炎症因子與自身免疫抗體滴度的變化，當貧血症狀顯著改善或者炎症因子水平與自身抗體滴度顯著升高時，應當及時調整補鐵劑量。
關於DNA羥甲基化
羥甲基化5hmC是哺乳動物基因組上的第六鹼基，在發育、衰老、神經退行性疾病、複雜疾病及腫瘤發生過程中起重要作用。DNA羥甲基化是近年發現的一種新的DNA修飾並迅速成為研究熱點。隨著研究的深入，發現之前被認為是檢測DNA甲基化標準的重亞硫酸鹽測序並不能區分DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC）。
傳統BS轉化無法區分5mC和5hmC
傳統的Bisulfite測序中，5hmC經過Bisulfite處理後變為CMS，CMS在測序中仍然被讀作C鹼基，因此不能區分5mC和5hmC。
化學氧化法結合重亞硫酸鹽轉化的測序技術（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），該技術不僅可以精確檢測DNA甲基化，排除DNA羥甲基化的影響，還可以雙文庫結合同時單鹼基解析度精確檢測DNA羥甲基化。
目前羥甲基化測序技術滿足多種應用需求：
- 全基因組氧化甲基化測序（oxWGBS）
- 簡化基因組氧化甲基化測序（oxRRBS）
- 目標區域靶基因氧化甲基化測序（Target-oxBS）
- 羥甲基化DNA免疫沉澱測序（hMeDIP-seq）
專注表觀組學十餘年，歡迎一起交流討論～
參考文獻：DOI:10.1172/JCI152345
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