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DNA甲基化與腫瘤發生： DNA甲基化水平和模式的改變是腫瘤發生的一個重要因素。這些變化包括CpG島局部的高甲基化和基因組DNA低甲基化狀態。如圖1左所示，在正常細胞中，位於抑癌基因啟動子區域的CpG島處於低水平或未甲基化狀態，此時抑癌基因處於正常的開放狀態，抑癌基因不斷表達抑制腫瘤的發生。而在腫瘤細胞中，該區域的CpG島被高度甲基化，染色質構象發生改變，抑癌基因的表達被關閉，從而導致細胞進入細胞周期，雕亡喪失，DNA修復缺陷，血管生成以及細胞粘附功能缺失等，最終導致腫瘤發生。同樣，如圖1右所示，對於在正常細胞中處於高度甲基化的一些基因和重復序列，如果其甲基化水平降低，這些基因將表達和重復序列將激活，從而導致基因印記丟失，細胞過度增長，不合適的細胞特異性表達，基因組脆性增加，以及內寄生序列(endoparasitic sequence)的激活，最終也導致腫瘤發生。

圖1. 腫瘤生成中的DNA甲基化改變模式 (取自Esteller M，Nat Rev Genet 2007, 8(4):286-298) 由於CpG島的局部高度甲基化要早於細胞惡性增生，故其甲基化的檢測可用於腫瘤的預測，而全基因組水平的低水平甲基化狀態，則隨著腫瘤惡性程度的增加而進一步降低，使其可用於腫瘤的診斷以及分級。近年來，不斷有研究顯示人類腫瘤的發生、發展與DNA甲基化的異常有關,而且早在腫瘤臨床確診之前就可檢測出特異基因的甲基化異常現象。所以甲基化可以作為腫瘤等早期診斷的生物標記物和預後評估指標，對腫瘤的篩查和風險評估、早期診斷、分期分型、預後判斷及治療監測都具有重要的意義。

DNA甲基化檢測方法： 隨著DNA甲基化研究的不斷深入，其檢測方法也層出不窮。這些方法針對不同研究目的，運用不同的處理方法，幾乎涵蓋了從基因到基因組各個層次水平的研究。據檢測樣本不同，可以分為DNA和mRNA。現有方法，絕大部分都是取樣於細胞的DNA，根據研究水平，又將這些方法歸為3大類，即：基因組甲基化水平(Methylation Content)的分析，候選基因甲基化分析，和基因組層次的DNA甲基化模式(Methylation pattern)與甲基化譜(Methylation Profiling)分析。主要方法分述如下：

A．基因組甲基化水平(Methylation Content)的分析:1. 高效液相色譜(High-performance Liquid Chromatography, HPLC)

HPLC是一種比較傳統的方法，是根據DNA或蛋白分子量和構象的不同而使其加以分離。由於在動態相和靜態相下分子的光吸收度並不相同而加以定量。隨著系統的壓強的增加，其分辨率增高。故而能夠定量測定基因組整體水平DNA甲基化水平。該方法由Kuo等1980 年首次報道。過程是將DNA樣品先經鹽酸或氫氟酸水解成堿基，水解產物通過色譜柱，結果與標準品比較，用紫外光測定吸收峰值及其量，計算5 mC/(5mC+5C)的積分面積就得到基因組整體的甲基化水平。這是一種檢測DNA甲基化水平的標準方法。2. 高效毛細管電泳法(High-performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 這是一種利用窄孔熔融石英毛細管來從復合物中分離不同化學組分的技術。其基礎是在強電場下不同分子的由於其所帶電荷，大小，結構以及疏水性等不同而相互分開。用HPCE方法處理DNA水解產物來確定5mC水平，簡便，經濟且敏感性高。 在這兩種方法的基礎上，不斷有新方法改進，包括，變性高效液相色譜(DHPLC)，逆向高效液相色譜(Reversed phase HPLC)以及HPLC與薄層色譜(Thin-layer Chromatography, TLC)相結合的HPLC-TLC方法。除上述方法外，還有其他原理的檢測方法，如單純的TLC方法以及最佳近鄰TLC(Nearest neighbour TLC)，基於抗5mC的免疫學技術(Anit-5mC immunological techniques), SssI 甲基轉移酶法(SssI methyl Acceptance Assay)，在重亞硫酸鹽處理的基礎上而進行的氯乙醛反應法(Chloacetaldehyde reaction)和酶區甲基化分析(Enzymatic Regional methylation Assay, ERMA)。 必須指出，以上各種方法雖然能夠明確檢測出目的序列中所有CpG位點的甲基化狀況，但並不能對甲基化位點進行定位。

B．候選基因(Candidate Gene)甲基化分析:1. 甲基化敏感性限制性內切酶-PCR/Southern法( methylation-sensitive restriction Endonuclease -PCR/Southern, MSRE-PCR/Southern) 這種方法利用甲基化敏感性限制性內切酶對甲基化區的不切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段後，進行Southern或PCR擴增分離產物，明確甲基化狀態再進行分析。常使用的甲基化敏感的限制性內切酶有HpaⅡ-MspⅠ(CCGG)和SmaⅠ-Xmal(CCCGGG)等。2. 重亞硫酸鹽測序法(Bisulphite Sequencing) 該方法首先用重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴增所需片段,則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶，最後,對PCR產物進行測序並且與未經處理的序列比較,判斷是否CpG位點發生甲基化。此方法是精確度很高，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態，但需要大量的克隆測序,過程較為繁瑣、昂貴。3. 甲基化特異性的PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR) 該方法同樣DNA先用重亞硫酸鹽處理，隨後行引物特異性的PCR。其設計兩對引物，分別與重亞硫酸鹽處理後的序列互補配對，即一對結合處理後的甲基化DNA鏈，另一對結合處理後的非甲基化DNA鏈。檢測MS-PCR擴增產物，如果用針對處理後甲基化DNA鏈的引物能擴增出片段，則說明該被檢測的位點存在甲基化；反之亦然。4. 甲基化熒光法(MethyLight) 結合重亞硫酸鹽處理待測DNA片段，設計一個能與待測位點區互補的探針，探針的5’端連接報告熒光，3’端連接淬滅熒光，隨後行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸時，TaqDNA聚合酶5′到3′端的外切酶活性會將探針序列上5′端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，這樣報告熒光發光，測定每個循環報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及水平。本方法高效，迅速，具備可重復、所需樣本量少、不需要電泳分離的特點。5. 焦磷酸測序(Pyrosequencing) 該方法，由4種酶催化同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就能將其加入到引物鏈中並釋放出等摩爾數的焦磷酸(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，並由PyrogramTM轉化為一個峰值，其高度與核苷酸數目成正比。當用於甲基化檢測時，經重亞硫酸鹽處理的序列可以看作是C-T型的SNP改變。其操作簡單，結果準確可靠，可以行大規模分析。6. 結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法(combined bisulfiterestriction analysis, COBRA) 這種方法對標本DNA行重亞硫酸鹽處理及PCR擴增，處理後原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶變為胸腺嘧啶。隨後用限制性內切酶對轉化後PCR產物切割的特性以識別原標本DNA的甲基化狀況。該方法相對簡單，不需預先知道CpG位點及樣本序列。

C. 基因組範圍的DNA甲基化模式(Methylation　pattern)與甲基化譜(Methylation Profiling)分析: 1. 限制性標記基因組掃描(Restriction Landmark Genomic Scanning, RLGS) RLGS是最早適用於基因組範圍DNA甲基化分析的方法之一。該方法先用甲基化敏感的稀頻限制性內切酶NotⅠ消化基因組DNA，甲基化位點保留，標記末端、切割、行一維電泳，隨後再用更高頻的甲基化不敏感的內切酶切割，行二維電泳，這樣甲基化的部分被切割開並在電泳時顯帶，得到RLGS圖譜與正常對照得出缺失條帶即為甲基化的可能部位。2. 甲基化間區位點擴增(amplification of inter-methylated sites, AIMS) AIMS是基於任意引物PCR(Arbitrary Primed PCR)的一種方法，由於任意引物PCR使用寡核苷酸連接子(linker) 進行連接，不需要依賴任何序列的先驗信息。在該方法中，用來進行擴增的模板序列首先通過甲基化敏感的限制性內切酶進行消化而富集，其特異性由該酶酶切片斷一端的特定序列結合連接子來保證。隨後，由內切酶進行第二次消化，再次連接，提純進行PCR擴增，最後電泳，提取目的序列進行測序。3. 甲基化CpG島擴增(Methylated CpG-island amplification, MCA) MCA也是基於任意引物PCR的方法，該方法使用兩種對甲基化具有不同敏感度的限制性內切酶(如SmaI和XmaI)先後進行消化，然後對甲基化敏感的限制性酶切片斷進行接頭(Adaptor)連接，行PCR，那些富含CpG的序列就會被選擇性的擴增。該方法對甲基化分析和克隆甲基化差異性基因都非常有幫助。4. 差異甲基化雜交(Differential Methylation Hybridization,DMH) DMH屬於一種芯片技術，在該技術中，包括擴增子(Amplicon)生成和CGI文庫篩選兩個重要組成部分。在擴增子生成中，首先用MseI來酶切DNA樣本，然後接上連接子，並去除重復序列，這時的樣本一分為二，其一直接進行PCR擴增，生成僅由MseI處理過的擴增子，而另一半則用甲基化敏感的酶BstUI進行消化,然後進行PCR擴增，生成由MseI/BstUI共同處理過的擴增子。CGI文庫通過篩查出重復序列，然後進行PCR，選出含有BstUI位點的克隆，最後這些克隆一式兩份點到芯片上，制備成CGI芯片。然後把兩種不同的擴增子分別雜交到相應的CGI克隆點上，最後通過差異性對比檢測出那些未甲基化位點。5. 由連接子介導PCR出的HpaII小片斷富集分析(HpaII tiny fragement Enrichment by Ligation-mediated PCR, HELP) 該方法用HpaII與其對甲基化敏感同裂酶MspI對同一基因組序列進行消化，產生不同的代表性序列，然後對此序列進行連接子介導的PCR，瑞和進行電泳等比較分析或將此DNA樣本共雜交到基因組芯片上進行分析。這種方法已經揭示了大量的組織特異性，差異甲基化區域，並用於正常細胞和癌癥細胞的基因組比較分析。6. 甲基化DNA免疫沈澱法(Methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP) 這是一種高效富集甲基化DNA的方法。在該方法中，可與5mC特異性結合的抗體加入到變性的基因組DNA片段中，從而使甲基化的基因組片斷免疫沈澱，形成富集。通過與已有DNA微芯片技術相結合，從而進行大規模DNA甲基化分析。該方法簡便，特異性高，適合DNA甲基化組學(DNA Methylome)的分析。 通過以上論述，不難看到檢測甲基化的方法不斷湧現，一方面說明其研究難度之大，另一方面也說明種種方法都有其局限性，諸如對酶的依賴，PCR擴增的問題，芯片數據分析的標準化問題等等。 綜上所述，各種表觀基因組學技術方法使我們可以繪制出諸如DNA甲基化以及組蛋白修飾模式的詳細圖譜，為我們研究甲基化的生物學功能，以及在腫瘤生成中的作用，以致腫瘤預防，診斷，治療和預後方面提供更多信息。然而，為了實現這個宏遠目標，需要的不僅僅是支助的增加，還有國際同行的密切合作。

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DNA甲基化及其測量方法（轉）