Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic Single Cell Sequencing
Title:
Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic Single Cell Sequencing
課題的目的和意義:
Ductal carcinoma in situ (DCIS,原位導管癌)是一種早期的乳腺癌,很少發展成invasive ductal carcinoma(IDC,浸潤型導管癌).由於瘤內異質性和導管中腫瘤細胞數量低,因此很難刻畫在侵襲期間的基因組進化過程。為了克服這個障礙,作者開發了Topographic(地形圖的) Single Cell Sequencing方法,測量單個腫瘤細胞的基因組拷貝數譜,同時保留其在組織切片中的空間背景
作者將該方法應用在10例同時具有DCIS和IDC區域的患者,包含了1,293個細胞.作者發現DCIS和IDC之間不僅有著直接的基因組譜系,並且在IDC中的亞克隆群體顯示大多數突變和拷貝數畸變在入侵前就已經在管道內發生了。
作者認為得到的結果支持多克隆入侵模型,其中一個或多個克隆逃離導管並遷移到鄰近組織中以建立侵襲性癌。
研究背景:
1) DCIS是最常見的早期乳腺癌通常routine mammography(常規乳房攝影)就可以發現,其中只有一小部分(10%–30%)的病例會發展成IDC
2) 關於癌癥的浸潤侵襲,已經建立了很多模型:
A) independent lineage model
支持該模型的認為原位腫瘤和侵襲腫瘤是平行進化並且在基因組的畸變上沒有共通之處
B) evolutionary bottleneck model
支持該模型的認為有多個克隆在導管內進化,之後單個克隆逃脫基底膜並擴展形成侵襲性腫瘤塊
C) muticlonal invasion
支持該模型的認為有多個克隆在導管內進化,之後有多個克隆逃脫基底膜並擴展形成侵襲性腫瘤塊
3) Single-cell DNA sequencing已經成了一項重要的工具用於解決腫瘤內異質性,描繪基質細胞類型(腫瘤微環境)以及發現稀有亞克隆.
4) 細胞分離手段是制約單細胞測序技術的一大因素,
a) Fluorescence-activated cell sorting (FACS)
根據熒光標記將一個細胞群分為多個亞群,根據所染熒光團的類型,可將熒光團偶聯抗體染色細胞彼此分離
b) Micromanipulation(顯微)
利用顯微操作儀進行細胞分離
c) Microdroplets(微滴)
在微流體通道內以小水滴進行實驗,相互之間通過連續的油相分離。
d) Nanowells(納米孔)
熒光標記的細胞加入到制造的納米孔中並使用高速落射熒光顯微鏡成像
以上制備細胞懸液方法都失去了其空間位置信息,而組織病理學信息在研究侵襲型腫瘤時是至關重要的
5) 作者為了克服這個限制,設計了新的單細胞測序方法Topographic Single Cell Sequencing,結合Laser-catapulting(激光彈射)測定癌細胞的體細胞拷貝數譜同時保留其在組織中的空間位置信息.
拷貝數流程:
10對來自乳腺癌病人的同步DCIS-IDC以及癌旁鄰近組織取自UT MD Anderson Cancer Center Breast Tissue Bank.病人的年齡在36-77,IHC定義的ER及 PR status of < 1%,FISH分析得到的Her2/CEP17 < 2.2
1) 冷凍組織切片染色及組織掃描
H&E (Haematoxylin and Eosin)是兩種染色劑,在收集待測序的細胞之前,使用PALM MicroBeam上的AxioCam iCC 1以10倍放大率掃描組織切片。掃描切片是為了成像以後方便後面的激光分離細胞.
2) 利用激光彈射分離單細胞
經過前面的組織掃描以後,通過組織病理學特征(大小,形狀,和最近導管的距離)分類出原位和浸潤的導管癌細胞.然後利用激光彈射將單細胞分離下來,分離前後的對比是為了確定儀器的參數設置.
3) 收集並存放單細胞
利用Laser-catapulting transfer將激光彈射得到的細胞每個都單獨的存放在一個tube中.
4) 單細胞基因組擴增
將單細胞擴增到96個副本,然後使用Degenerative-Oligonucleotide-Primer PCR (DOP-PCR)進行全基因組擴增.
為了保證質量,通過電泳確定WGA DNA片段的大小分布,只保留大於300bp片段大小的樣品並純化.
5) 全基因組測序
用 HiSeq4000 system進行全基因組測序
6) 圖像數據處理
確定每個單細胞的明場圖像和xy軸位置,為了定位組織位置
7) 處理拷貝數變異數據
A) bcl2fastq將BCL(base call)文件轉換到FASTQ文件
B) 用Bowtie 2 (2.1.0)將FASTAQ文件映射到hg19參考基因組 ,得到BAM文件
C) SAMtools (0.1.16)對得到的BAM文件排序
D) 使用SAMtools標記並去除PCR重復物
E) 經過‘variable binning’ pipeline處理後得到read count
F) 使用circular binary segmentation (CBS) method
{R Bioconductor ‘DNAcopy’ package} 得到segmented mean
[alpha = 0.0001,undo.prune = 0.05]
G) 用{dbscan}進行技術性噪音檢測,過濾其中噪音過大的單細 胞
‘variable binning’ pipeline
Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic Single Cell Sequencing