第一代測序技術介紹
第一代測序技術介紹
黃金的一代測序大夥肯定好奇啥是黃金測序，標題很搶眼，但的的確確存在測序的黃金標準：一代測序了，小編故稱之為黃金測序。
今天給你們帶來一些低門檻純經驗的黃金測序（哈哈就是一代測序了）中你應該知道的point：
高通量測序最近這幾年很火越來越火，但是世界上更多的還是一幫天天做分子克隆、養細胞、養細菌、雜蛋白的生物學家，究其原因Sanger測序還是測序屆的金標準，由於精確度高於2、3代測序且保持大白菜價格使之地位穩固，那麼我們就來看看普及率最高的一代測序分析中出現的一些情況及解決方案：
1.測序結果不到800Bases是什麼原因？
（1）G/C rich、G/C Cluster。
這種情況一般表現為測序訊號突然減弱或消失(圖1，圖2)
如在DNA樣品中的DNA序列分佈勻稱，沒有複雜結構時，正常的測序反應能保證達到800Bases以上。但有一些DNA樣品立體結構複雜，造成聚合酶延伸反應終止，測序訊號突然減弱或消失，或者測序結果出現套峰現象，出現這些現象的原因由DNA模板本身所造成。
圖1 GC引起的訊號減弱
圖2 G/C rich引起的訊號消失
（2）A、T的Poly結構
這種情況一般表現為A、T連續結構後面的測序結果出現套峰。根據文獻記載。原因在於聚合酶進行聚合反應時，由於A或T的連續，聚合酶難以識別完整的每個A或T，在某個A或T的後面便開始進行A或T連續結構以後序列的聚合反應(打滑現象)，造成測序結果紊亂，出現套峰。一般在多少個A或T的後面能出現這種情況呢？現在還沒有這方面的報道。根據我們的經驗，這一情況的出現和A或T的連續結構後面的序列的排列情況有著直接的關係。有時10多個A或T的連續結構後面便出現套峰，但有時60～70個A或T的連續結構後面的序列也一樣可以完整地讀出來。具體情況還有待考證。一般來說，PCR片段直接測序時，A或T的連續結構後面的序列測序結果都會出現套峰。原因在於測序時經歷了PCR反應及測序反應(測序反應本身也是PCR反應)二次聚合酶的打滑現象。
圖3 polyA引起的套峰
（3）原因不明的複雜結構，測序結果出現突然訊號減弱或消失
從序列上看，DNA鹼基排列並無特別異常。估計是DNA整體出現複雜結構，從某一位置開始聚合酶的聚合反應便無法進行。
圖4 複雜結構引起的訊號中斷
2.出現套峰是什麼原因？
在測序反應中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，歸結其形成原因有以下幾點：
（1）測序引物在模板上有兩個結合位點(圖5)；
（2）模板不純，如果是質粒或是菌液，原因是非單克隆(圖6)，如果是PCR,原因為非特異性條帶(圖7)；
（3）模板序列的特殊結構，如poly結構、髮卡結構等(圖8)；
（4）引物降解，或引物不純(圖9，圖10)。
圖5 雙引物結合位點引起的套峰
圖6 由於質粒或菌液為非單克隆引起的套峰
圖7 PCR為非特異性條帶引起的套峰
圖8 模板特殊結構引起的套峰
圖9 引物輕微降解或引物不純引起的套峰
圖10 引物嚴重降解或引物不純引起的套峰
解決方案彙總
1.樣品測序無訊號
可能是引物結合位點不存在或被破壞；建議更換引物測序或重新提供樣品測序。
2.樣品測序訊號差
可能是引物或模板的質量不高或是引物和模板的匹配性不好引起的，也可能是樣品濃度偏低；建議提供高質量樣品測序。
3.樣品測序衰減
可能是由於特殊結構如Poly結構、重複序列、迴文結構、髮卡結構、GCrich、AT富集等導致的測序衰減，由於是樣品本身結構問題無法優化建議反向測序進行拼接以得到完整序列，還有一種衰減的情況就是在一段正常峰型後逐漸衰減，可能是模板量反應量不足導致，建議製備高濃度模板測序。
4.樣品測序套峰
套峰細分的話有如下幾種情形:
①全雙峰：多引物結合位點（針對菌液、質粒樣品），非特異性擴增（針對PCR產物）；
②前雙峰：多引物結合位點，其中一套模板測序中斷（針對菌液、質粒樣品），多引物結合位點（PCR未純化樣品），引物二聚體或小片段干擾（針對PCR已純化樣品）；
③中間雙峰：非單克隆（針對質粒、菌液樣品），鹼基缺失或等位基因雙模板（針對PCR未純化樣品）；
④後雙峰：非單克隆（針對菌液、質粒樣品），鹼基缺失（針對PCR樣品）；
針對二聚體及小片段干擾的情況建議電泳切膠回收純化；針對多引物結合位點的情況建議更換引物測序或反方向測通樣品；針對鹼基缺失建議克隆測序；針對非單克隆建議在克隆無誤的前提下重新挑取單克隆測序；針對非特異性擴增建議優化反應條件重新制備樣品測序；針對等位基因雙模板建議克隆測序。
5.樣品測序中斷
可能樣品存在特殊高階結構，導致dNTP和ddNTP在某一鹼基位點後無法與模板結合，測序酶無法繼續延伸，建議使用反向引物進行測序經拼接後可以得到完整序列；或酶切後亞克隆測序。
6.樣品測序移碼
測序從開端發生移碼可能是引物發生降解，建議重新提供引物；測序區域性出現移碼，可能樣品存在特殊高階結構，建議反向測通。
7.樣品測序底峰干擾
可能測序引物不純，建議將引物進行PAGE膠純化後在進行測序或重新提供引物測序；可能測序樣品不純，混有正、反向引物，建議重新制備樣品測序。