bowtie:短序列比對的新工具
bowtie:短序列比對的新工具（轉）
(2014-11-17 22:15:24)
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Bowtie是一個超級快速的，較為節省記憶體的短序列拼接至模板基因組的工具。它在拼接35鹼基長度的序列時，可以達到每小時2.5億次的拼接速度。
Bowtie並不是一個簡單的拼接工具，它不同於Blast等。它適合的工作是將小序列比對至大基因組上去。它最長能讀取1024個鹼基的片段。換言之，bowtie非常適合下一代測序技術。
在 使用bowtie前，需要使用bowtie-build來構建比對模板。如果你需要比對是比較常見的基因組的話，你可以去http://bowtie- bio.sourceforge.net/manual.shtml下載你所需要的Pre-built indexes檔案就可以了。
如 前所述，bowtie適合於將短序列拼接至大的模板上，尤其是基因組。模板最小尺寸不能小於1024鹼基，而短序列最長而不能超過1024鹼基。 Bowtie設計思路是，1）短序列在基因組上至少有一處最適匹配， 2）大部分的短序列的質量是比較高，3）短序列在基因組上最適匹配的位置最好只有一處。這些標準基本上和RNA-seq, ChIP-seq以及其它一些正在興起的測序技術或者再測序技術的要求一致。
如果bowtie在你的機器上執行起來很慢，那麼你可以試試以下的一些辦法來讓它跑得快一些：
- 盡 可能的使用64位bowtie。很顯然，64位運算會比32位運算更快。所以最好使用支援64位運算的計算機來執行64位的bowtie。如果你是從原文 件開始編譯程式，在g++編譯時，你需要傳遞-m64引數，你也可以在make的時候加入這一資訊，比如說傳遞BITS=64給make，具體 的：make BITS=64 bowtie。想知道你自己運算的是什麼版本的bowtie，你可以執行bowtie –version
- 如果你的計算機有多個CPU或者CPU核心，那麼請使用-p引數。-p引數會讓bowtie進入多執行緒模式。每一個執行緒都會使用單獨的CPU或者CPU核心。這種並行的運算模式也會大大加快運算速度。
- 如 果你的報告檔案中每條短序列都有太多的匹配位點（超過10）那麼你可以試著重新使用bowtie-build加上 –offrate引數，如bowtie-build –offrate 4。-o/–offrate預設值為5，每下降1，比對速度會增加1倍，但是系統消耗（硬碟空間和記憶體）也會加倍。
- 如果你的系統 配置太低，比如記憶體不足4GB，那麼建議你在bowtie的時候使用–offrate引數。與上一條相反的，你需要加大offrate的值。bowtie –offrate 6. 其預設值為5。每增加1，記憶體空間的要求下降，這樣會減少讀取硬碟當中虛擬記憶體的次數，速度反而會有所上升。
-n模式與-v模式。
預設的，bowtie採用了和Maq一樣的質量控制策略，設定 -n 2 -l 28 -e 70。總的來說，比對模式分為兩種，一種是 -n 模式， 一種是 -v 模式，而且這兩種模式是不能同時使用的。bowtie預設使用-n模式。
-n模式引數： -n N -l L -e E
其中Ｎ，Ｌ，Ｅ都為整數。-n N 代表在高保真區內錯配不能超過Ｎ個，可以是0?3，一般的設定為2。-l L代表序列高保真區的長度，最短不能少於5，對於短序列長度為32的，設定為28就很不錯。-e E代表在錯配位點Phred quality值不能超過E，預設值為40。Phred quality值的計算式為：-10 log(P,base(10))
| Phred Quality值 | 錯配可能性 | 正配可能性 |
| 10 | 1/10 | 90％ |
| 20 | 1/100 | 99％ |
| 30 | 1/1000 | 99.9％ |
| 40 | 1/10000 | 99.99% |
| 50 | 1/100000 | 99.999% |
而-v模式的引數相對較少。
-v模式引數：-v V
其中V為整數。-v V代表全長錯配不能超過Ｖ個，可以是0?3。這時，不考慮是否高保真區，也不考慮Phred quality值。
–best 與–strata
–best 引數代表報告檔案中，每個短序列的匹配結果將按匹配質量由高到低排序。–strata引數必須與–best引數一起使用，其作用是隻報告質量最高的那部 分。所謂質量高低，其實就是指錯配的鹼基數，如果指定了-l L引數，那就是在高保真區內的錯配數，否則就是全序列的錯配數。如果你還指定了 -M X的話，那就會在質量最高的當中，隨機選擇X個來報告。也就是說，當我們指定了-M 1 –best –strata的話，那就只報告1個最好的。
對於輸入，-q是指輸入的檔案為FASTQ(副檔名通常為.fq或者.fastq)格式；-f是指輸入檔案為FASTA(副檔名通常為.fa, .mfa或者.fna)格式；-c是指在命令列直接輸入要比對的序列。
下面就是一個具體的例子：
bowtie -v 2 -M 1 –best –strata Genomes/hg19_ebwt/hg19 Pol2ChIP.fastq Pol2ChIP.map
1.本人用過的短序列比對工具裡，感覺bowtie最好使，大體用法和blast挺像的，也很簡單，就兩步：
第一步，build：感覺和blast的第一步formatdb差不多，在命令列輸入bowtie-build <seqfile> <dbname>
第二步，align：和blast的核心（blastall）差不多，在命令列輸入：bowtie [options]* <dbname> <short_reads_file> <outfile>
bowtie的速度比Maq和SOAP都快，PC機上也能勝任大規模資料分析，一般100M大小的基因組做mapping，2-3min就可以了，快的讓我不敢接受，呵呵，bwt演算法就是牛！
bowtie的用途不僅僅是短序列比對最mapping，更多資訊請參考：
http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml
2.
Bowtie aligner 簡介
| 軟體簡介 | Bowtie is an ultrafast, memory-efficient short read aligner |
|---|---|
| 核心技術 | Mapping / Burrows-Wheeler / FM Index |
| 原創作者 | Ben Langmead / Cole Trapnell |
| 維護狀況 | 0.12.3 release - 2010/02/17 |
| 輸入格式 | FASTQ |
| 輸出格式 | SAM / Bowtie default format |
| 適用機器架構 | i386 / x86_64 |
| 作業平臺 | Linux, Windows, and Mac OS X |
使用說明
本軟體目前安裝於BIP2(140.123.126.234)主機, 實驗帳號為Bioinfo 若有需要利用此軟體進行實驗, 請與 冠巨集/盈達 聯絡索取實驗帳號資料
軟體目錄目標路徑: /home/bioinfo/alignmentTool/bowtie-0.12.3
Getting started
Building a new index
Performing alignments
Finding variations with SAMtools
準備資料
Reference genome data (*.fa)
NGS Short reads data (*.fastq)
Building a new index
根據 reference genome data(e.g. reference.fa) 建立 Index File
# bowtie-build [options]* <reference_in> <ebwt_base>
Performing alignments
NGS short reads data (e.g. leftRead.fastq / rightRead.fastq)
refernece genome data(e.g. reference.fa)
# bowtie [options]* <ebwt> {-1 <m1> -2 <m2> | --12 <r> | <s>} [<hit>]
Solid data for single-read alignment
# bowtie -S -a -f -C -p 7 <reference-index> <singleRead.csfasta> -Q <singleRead.qual> > <alignResult.sam> -S :輸出為sam檔 -a :把所有對到的read列出來，即使有multiple mapping -C :input為.csfasta -Q :.csfasta 內容裡無 quality value，所以需準備 .qual -f :伴隨 -Q -C 引數 -p int :用幾顆cpu跑
If bowtie Paired end 100% failed to align
> http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=6522
Finding variations with SAMtools
輸出sam格式
# bowtie -S e_coli reads/e_coli_10000snp.fq ec_snp.sam
轉成bam格式
# samtools view -bS -o ec_snp.bam ec_snp.sam
排序bam資料
# samtools sort ec_snp.bam ec_snp.sorted
結合bam資料
# samtools merge <out.bam> <in.bam> | <in.bam> …
找尋SNP
# samtools pileup -cv -f genomes/NC_008253.fna ec_snp.sorted.bam
其他
參考資料
Langmead B, Trapnell C, Pop M, Salzberg SL.. 2009. Genome Biology
Bowtie Introduction on NCBI Presentation
相關連結
http://bioinfo.cs.ccu.edu.tw/wiki/doku.php?id=bowtie