RNA-seq資料綜合分析教程

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mRNA-seq是目前最常用的高通量測序技術，一般的用法就是看看基因表達譜，尋找差異表達的基因。我和高通量測序資料分析結緣，也是因為RNA-seq。

一開始我對mRNA-seq資料分析一無所知，跑了"tophat+cufflinks"的流程也不知道每一步的原因，把“RNA-seq data analysis：A pratice approach” 看了好幾遍，也是雲裡霧裡，當然這些時間並沒有白白浪費，終於有一天我恍然大悟，感覺自己終於懂了mRNA-seq資料分析，於是在暑假通過一次實戰對自己的所學做了一個總結。

• 轉錄組入門（1）：軟體準備
• 轉錄組入門（2）：讀文章拿到測序資料
• 轉錄組入門（3）：質量控制
• 轉錄組入門（4）：瞭解參考基因組及基因註釋
• 轉錄組入門（5）： 序列比對
• 轉錄組入門（6)： reads計數
• 轉錄組入門（7）：差異表達分析
• 轉錄組入門（8): 富集分析

但是到目前為止，我實際遇到mRNA-seq資料分析分析專案就一個，不過問我問題的人還是有的，於是打算一邊整理實驗的流程，再稍微整理下自己的對這方面的理解。

先來看一道RNA-seq資料分析的題目吧，能解決這道題目意味著你真的理解了RNA-seq資料分析。這道問題很簡單，不需要強大的計算能力，只需要一張紙和一支筆而已。

這道題目出自 The biostar handbook

假設有一個物種非常的小，僅僅只有三個基因： A, B, C，並且這三個基因都轉錄本長度分別為10bp, 100bp, 1000bp. 你想通過兩個不同的條件下研究該物種，分別是野生型(WT)和熱激後(HWEAT)。

由於神祕力量，你知道在WT條件下，基因A的表達量是基因B的表達量的兩倍，你還知道在WT和HEAT兩個條件中只有一個基因發生了變化（其他基因不變），並且該變化能用目前研究手段中檢測到。

你為了找那個在WT和HEAT裡不同的基因，非常激動的去做了一次沒有重複的RNA-seq實驗。由於你很激動，所以不小心把樣本混在了一起，而且混了比HEAT處理多一倍WT的DNA量。不過好訊息是樣本還是能夠分開的，畢竟加了barcode。最終結果就是你測了2倍的WT DNA和一倍的HEAT。

問題：你需要準確的用read覆蓋情況來表徵根據上述給的條件。數字不重要，你可以隨便寫，重點是這些數字能夠表徵基因的表達情況。請用實際的數字來替代下面的問號部分

思考題：當你覺得你選擇的數字能夠回答上面的問題，那麼再來想想下面的題目，如果你能回答所有問題，那麼那就理解RNA-seq是如何工作的啦。

• 由於你在儀器裡放了兩倍WT材料，你是如何區分出你的樣本？
• 每個條件下，每個基因的CPM是多少？
• 每個條件下，每個基因的RPKM是多少？
• 每個條件下，每個基因的TPM是多少？
• 你怎麼知道基因在WT樣本中，基因A的表達量真的是基因B表達量的兩倍？
• 你能知道WT和HEAT處理中表達量發生變化的基因嘛？
• 當前面的3X2的位置的“？”都有了正確的值，這個問題也是可解決的嘛？

然後，你可以再想想：

• 你需要測多少的read，才能讓CPM有一個不錯的數值？
• 你需要測多少的read，才能讓RPKM有一個不錯的數值？
• 你需要測多少的read，才能讓TPM有一個不錯的數值？
• 你覺得引入上述這些具有任意比例因子的措施是否有意義，還是隻為了讓數字看起來“很好”？