人類全基因組測序06

SNP(single nucleotide polymorphism)：有了10倍以上的覆蓋深度以後，來確認SNP信息，就相當可靠了。

一個普通黃種人的基因組，與hg19這個參考基因組序列相比，會有350萬個左右的SNP。又有大概2萬個是落在外顯子上的，而非同義的SNP有大概9千個。

所謂非同義的SNP，就是這些SNP是會引起蛋白質的序列變化的。

　　indel：(insertion & deletion)是指小於50個bp以內的微小的插入、和缺失突變。一個普通黃種人的基因組和hg19相比，約有50萬個Indel。其中落在外顯子上的，大概在1千個左右。

　　　　那麽Indel如果一旦落在外顯子區域，它一定會

　　　　　　如果它引起的是移碼突變，那麽在移碼位點之後，所有氨基酸序列就和原來的序列完全不同。

　　　　　　如果它（基因）還能保持原來的閱讀框，也會引起蛋白質中若幹個氨基酸的增或者減。

　　SV： structure variation 染色體結構變異

　　　　 1、 染色體內部的位移

2、 染色體之間的位移

3、 大片段的缺失

4、 大片段的插入

5、 大片倍的加倍

6、 大片段的倒位

　　CNV ：copy number variation 拷貝數變異，是指染色體片段的拷貝數變異：包括拷貝數增加，也包括拷貝數減少。

　　　　實際上，CNV是和結構變異（也就是SV）緊密相關的。SV 中的大片段的增加、和大片段的缺失，會直接導致CNV的變化。

突變種類與癌癥04

基因拷貝數異常：

　　例如：HER2基因，如果HER2基因的拷貝數增加到6個，或者更多，它就比較容易引發乳腺癌。

　　赫賽汀（Herceptin）這個藥，可以抑制HER2蛋白的活性，所以赫賽灑就對於由HER2基因拷貝數異常增加引發的乳腺癌，有非常好的治療作用。

染色體結構變異：

　　強啟動子替換了弱啟動子，改變了某個基因在天然條件下的表達量。

　　例如：EML4-ALK的融合基因。ALK是一個推動細胞生長、增殖的這樣一個基因。在野生型的條件下，它的表達量是比較低的。還有一個基因叫EML4基因，這個基因有一個強啟動子。

　　有一個藥物，叫克裏唑替尼（crizotinib）。這個藥對EML4-ALK融合基因導致的肺癌有非常良好的療效。

基因的點突變：

　　例如：BRAF基因的V600E突變。BRAF本身是個激酶，是打開下遊細胞增殖通道的一個開關。當BRAF的第600個氨基酸，從纈氨酸被突變到了谷氨酸之後，它的酶活性就被持續地活化，它就持續地打開下遊促進細胞分裂的這個信號通路。

　　維羅非尼（vemurafenib）這個藥物正好能夠抑制BRAF的這個激酶的活性，所以它能夠有效治療有BRAF V600E突變的腫瘤。

抑癌基因突變成無效基因

　　突變在大多數情況下，是使一個基因失去活性。只有在少數情況下，會增強一個基因的活性。

　　例如：TP53這個基因的最重要的一個功能，是在細胞受到傷害之後，TP53會引導細胞進行雕亡。

　　如果一旦TP53發生了突變，失去了功能，或者這個細胞徹底就把TP53這個基因搞丟了之後，細胞就不容易進入雕亡。 當它不容易進入雕亡呢，它也就有更大可能性變成腫瘤。 已經在很多的科學實驗中發現，大概在50%的腫瘤裏面，有TP53基因突變的情況存在。

RNA -seq：07

RNA-seq目的、用處：：可以幫助我們了解，各種比較條件下，所有基因的表達情況的差異。

比如：正常組織和腫瘤組織的之間的差異；檢測藥物治療前後，基因表達的差異；檢測發育過程中，不同的發育階段，不同的組織之間的基因表達差異 等

在所有檢測的差異類型中，最常用的一種檢測就是：檢測所有mRNA的表達量的差異。

還可以檢測 RNA 的結構上的差異。例如：mRNA的剪接方式的差異，即“可變剪接”；還可以檢測“融合基因”，同時還可以檢測基因單點突變導致的SNP。

測序方法、步驟：人的細胞或組織，一般抽提到的總RNA當中，95%都是核糖體RNA。剩下的2%到3%是mRNA。還有2%到3%是Long non-coding RNA、或者tRNA、microRNA等

先把核糖體RNA先去掉。然後再進行建庫測序。比如利用Poly(A)尾巴 抓出mRNA ，鎂離子溶液打斷，逆轉錄成cDNA ，再建庫擴增，測序

表達量指標：目前最常用的是RPKM值，對基因表達量進行相對定量的一個指標。RPKM是 Reads Per Kilobase of exon model perMillion mapped reads。

除以這個外顯子的長度，它的目的：是修正這個mRNA長度所引起的mRNA的Read數的偏差。

火山圖：針對全轉錄組的分析，表達的是一次看到一個整體的樣本（表達）差異的情況。

橫軸表示某個基因的表達量是上升或下降。縱軸是表示這種差異的置信程度。這其中的每個點，就是兩個樣本當中同一個基因的mRNA表達量的變化。

聚類分析圖：它是通過多個樣本的全基因表達譜對比，來找到它們之間的相似性，和相近關系。

一張聚類分析的圖，橫軸是樣本，縱軸是基因。

應用：我們可以分析疾病的亞型；還可以通過對多個基因在特定疾病當中的表達傾向性，來找出可能的、新的、診斷用的Biomark。

GO(gene ontology)分析：

GO主要描述基因的三個屬性：

第一，是這個基因，它參與的生物過程

第二，是這個基因產物的功能

第三、是這個基因產物在細胞器內的空間定位

差異基因GO富集柱狀圖：可以直觀的反映出在生物過程、細胞組分、和分子功能富集的差異基因的個數分布情況。 柱子越高，則表示這個亞類當中突變越多。

有向無環圖，是差異基因GO富集分析的圖形化展示方式，從上到下，它所定義的功能範圍越來越小、越來越精準。 它的分支，表示包含關系。而這個圈圈的顏色越深吶，表示這個富集關系程度越高。

通路(Pathway)分析：在系統水平上完成生物的某一功能的基本單元、或者局部子網絡。

散點圖是KEGG富集分析結果的圖形化展示方式。

在圖中，KEGG富集程度通 Rich factor、Qvalue 和 富集到此通路上的基因個數 來衡量。

富集因子越大，則表示富集的程度越大。 qValue是校正之後的pValue，它越接近於0表示富集程度越顯著。點面積越大吶，則富集的基因數越多。

RNA-seq中，可以測到mRNA上的各種結構上的變異，即RNA序列的變異。要求測序深度要更深。因為這樣才能得到較完整的覆蓋，更有把握判斷 新的剪接點、一個斷點、哪兒堿基發生了突變等。

結構變異分析：

可變剪接：一般一個人的組織樣本當中，可以通過高通量測序，發現有5000個到20000個左右的可變剪接。

基因融合：融合基因的示意圖，圓形 圓內弧線連接圖

點突變(SNP)：泡泡圖，泡泡越大 突變頻率越高，由大到小逆時針排列

外顯子組測序08

外顯子測序的核心技術，是這些針對人外顯子序列設計的捕獲探針庫；這些探針的序列，都和人外顯子的DNA序列相互補。

實驗原理、步驟：

超聲打碎，建成文庫；

雜交，探針上有生物素；

用磁珠(其上有鏈黴親和素與生物素結合)混合；

磁鐵吸附磁珠，去上清液，把DNA文庫從磁珠上洗脫

PCR，HiSeq測序

數據分析：比對 到人的基因組上；把比對到基因組的序列進行 突變分析

一般用Agilent SureSelect 50M的試劑盒進行外顯子建庫、捕獲。再用HiSeq 2500 V4 PE125的方法進行測序，測10個G的數據量。

在外顯子測序中，要扣掉4種因素引起的無效數據：

第一個是因為雜交捕獲的過程它不是十分精確的。基因組中有許多序列有一定的同源性的。這些片段，在雜交過程當中，也會被雜交捕獲下來，但不是基因的外顯子。

第二個，是捕獲下來的一個片段，很可能它只有一部分的序列是落在目標區域，還有一部分序列是突出在目標範圍之外的。這個落在目標區的數據，占全部被測到的數據的比例，即“捕獲效率”(capture efficiency)。那麽AgilentSureSelect這個試劑盒吶，它的捕獲效率，大約是65~70%。

第三個影響有效數據比例的因素，是Duplication。用Agilent SureSelect試劑盒進行建庫、捕獲，實測10個G的數據，發現duplication大約在5%左右。

第四個，是目前主流的測序方法是HiSeq V4 PE125這種方法。也就是：雙端各測125個堿基，那麽Agilent的建庫方法中當吶

WES在腫瘤測序中的優勢：

外顯子測序，可測Germline突變（胚胎形成時就帶有的突變），也可測體細胞突變（Somatic Mutation）

因為腫瘤中的突變吶，往往都是 low allele frequency（低等位基因頻率） 的體細胞突變。所以，外顯子組測序“深度測序”，顯出比較明顯的優勢來。

1. 測腫瘤中的體細胞突變，一般是拿手術切下來的腫瘤組織DNA、和病人外周血中的白細胞基因組DNA，進行外顯子測序。
2. 一般腫瘤的測100~200X的深度，白細胞的（DNA）測100X的深度。
3. 從白細胞DNA得到這個病人的Germline基因組序列，拿腫瘤的DNA序列與之做對比，找出其中的體細胞突變。

外顯子組測序，主要能夠得到的信息是點突變和插入缺失突變，也就是SNP、Indel信息。

找到突變之後，就可以進一步地做GO和Pathway分析。

• 外顯子測序對基因組的結構，變異--SV（Structure Variation），是不敏感的。因為外顯子測序，只測了基因組上1~2%的很小一部分區域，當 SV 的斷點不落在外顯子區域的時侯，外顯子測序是看不到這些斷點的
• 外顯子測序對拷貝數變異（CNV，copy numbervariation），不是很敏感。不敏感的原因吶，是因為雜交捕獲過程啊，是一個含了很高偶然性的過程。
• 往往是這樣做的：用全基因測序來找到腫瘤樣本中的結構，變異（SV）和拷貝數變異（CNV），再用來外顯子組測序來找腫瘤樣本中的、低頻的SNP和Indel體細胞突變。

Panel，往往是指針對若幹個基因設計一個捕獲試劑盒。診斷公司為診斷特定的疾病，設計了許多特定的、針對性的Panel。

這一類的Panel，它的建庫、捕獲、和測序原理，與外顯子組測序是完全一樣的。

xgene：WGS，突變與癌，RNA-seq，WES