作者簡介：焦碩，博士畢業於西北農林科技大學，目前在北京大學做博士後。

主編按：此文於2016年發表於Soil Biology and Biochemistry (IF=4.926)，文章思路清楚、圖表美觀，發表不到兩年引用24次(超雜誌平均引用2倍)，更被眾多同行選為學習的經典示範材料。今天誠邀本文第一作者講解此文，以饗讀者。

石油汙染土壤微生物群落構建與生物多樣性研究

引言

隨著分子技術的發展，土壤微生物生物地理學時間和空間的微生物分佈模式越來越多的受到關注。最初，環境因子被認為是影響微生物群落變化的主要驅動力，例如，土壤pH值、養分、土壤質地、氣候條件都可以顯著影響微生物群落分佈。然而，近期研究發現微生物的非隨機分佈不僅受環境因素的影響，還與地理距離顯著相關，地理距離可以限制微生物的擴散。土壤中包含多種多樣的微生物類群，為適應石油汙染環境，許多能降解有機汙染物的微生物會自然富集。在本研究中，作者利用高通量測序技術探索石油汙染土壤中微生物群落結構，分析環境因子和地理距離對微生物分佈的影響。樣品採自中國陝西洛川縣（JKH）、永坪鎮(YP)、延長縣(YC)、咸陽市(XY)、靖邊縣(JB)五個地區的石油汙染土壤。通過研究石油汙染地區的微生物群落組成、土壤環境因子與微生物群落之間的關係、地理距離對微生物群落的影響、響應石油汙染物的微生物的共發生模式等內容，擬揭示長期石油汙染地區，土壤微生物的生物地理分佈模式和生物多樣性，為生態系統修復和環境治理提供有價值的線索。

1. 微生物群落與環境因子

圖1（A）基於土壤理化特性的主成分分析，α-多樣性指數和土壤理化因子擬合子在排序圖中。（B）和（C）pH和總石油烴(TPH)含量與微生物豐富度之間的線性迴歸關係，總石油烴含量進行了對數變換。

縮寫：總氮 total nitrogen (TN), 可用氮 available nitrogen (AN), 總磷 total phosphorus (TP), 可用磷 available phosphorus (AP),可用鉀 available potassium (AK), 重金屬鎘 the heavy metals cadmium (Cd), 鉻chromium (Cr)和 鉛lead (Pb)。

以土壤理化因子作為變數進行主成分分析（圖1），α-多樣性指數包括：豐富度(Richness)，均勻度 (Evenness)，夏農多樣性(Shannon)和系統發育多樣性 (PD)被擬合到排序圖上。α-多樣性與土壤pH呈現正相關關係，而與TPH、TN和AP呈現負相關關係。土壤pH和總石油烴含量與微生物豐富度表現出顯著的線性迴歸關係。

取樣點地圖通過GenGIS II（Parks et al. 2013）製作，樣點地理位置與群落結構和環境差異之間的相關關係在圖中展示，不同取樣點的環境差異與微生物群落之間的相關關係如圖2，發現了很明確的對應關係，通過Mantel檢驗確定了這種對應關係的顯著性（r=0.4195，P=0.001）。

圖2 地理空間對映生物多樣性分析，樹狀圖是不同樣點間基於微生物群落結構的Bray−Curtis距離和環境因子的歐幾里德距離。彩色分支對應不同的樣點，白色分支表示包含兩個或兩個以上樣點，餅圖表示每個樣點所有樣品的平均門水平的相對丰度。

圖3（A）基於Bray−Curtis距離的限制性主座標分析；（B）偏最小二乘迴歸分析，環境因子用黑體表示，微生物類群用灰色字體表示。

接下來，作者通過基於Bray−Curtis距離的CAP分析（圖3A），探究環境因子對微生物群落差異的貢獻。在所有測定的理化因子中，pH、TPH、TN和Cd顯著影響微生物群落。而pH是其中貢獻最大的環境因子。為了證實結果的可靠性，最佳變數子集分析（BEST）確定了pH、TN、Cd和TPH是影響微生物群落結構差異最重要的環境因子。偏最小二乘迴歸分析用來揭示微生物類群與環境因子之間的相關關係（圖2-3B）。作者選取相對丰度大於0.5%，從門到屬水平，且能解釋大於40%方差的微生物類群。結果顯示，Cd與Desulfovibrionales、Thauera、Desulfomicrobium和Rhodocyclaceae存在強烈的正相關關係；TPH與Gammaproteobacteria、 Caulobacteraceae和Xanthomonadaceae呈現弱相關性；而pH與Acidobacteria-6、Solirubrobacterales和Ellin6529呈正相關。

2. 微生物群落的空間分佈與差異分解分析

群落相似度與地理距離之間存在顯著的負線性相關關係（圖4A，斜率=−0.034，P<0.001），Mantel 檢驗進一步證明了群落結構與地理距離之間的顯著關係（r= 0.342， P<0.001）。通過方差分解分析，對各因子（地理距離和土壤理化）的貢獻率進行定量，找到造成微生物群落差異的主要因素（圖4B）。基於CAP模型的前向選擇方法，共找到了四個環境因子包括：pH、TPH、Cd 和 TN，兩個PCNM變數和兩個線性趨勢變數。圖中方差分解的所有部分都經過置換方差檢驗為顯著的（P<0.01），所有因子一共解釋43.09%的微生物群落方差。土壤環境因子與空間變數（PCNM和線性趨勢變數）共同解釋了29.04%的微生物群落方差，表明空間變數和環境因子的影響很大程度上相互依賴。土壤環境因子單獨解釋了1.81%的微生物群落方差。而PCNM和線性趨勢變數分別解釋了3.74%和8.09%的微生物群落方差，其共同解釋的部分為0.41%，因此空間變數單獨解釋了12.24%的微生物群落方差。綜上所述，土壤理化因子和空間距離均能顯著影響微生物群落組成。

圖4 （A）微生物群落相似性與地理距離之間的相關關係，灰色的直線表示線性擬合。(B) 方差分解分析，Env表示環境因子，Trend表示線性趨勢，PCNM表示主軸鄰距法選出的變數

3. 共發生網路分析

共發生網路圖用來探究微生物之間的相互關係，選取相對丰度大於0.05%的屬進行Spearman相關性分析，篩選出相關係數大於0.6且顯著性P值小於0.01的相關關係構建相關性網路。網路圖共包含95個節點（屬）和446條邊，每個節點的平均邊數是9.389（圖5）。一些拓撲特性引數被計算並與同等大小的Erdös−Réyni隨機網路圖進行了比較。網路拓撲特性引數包括：平均路徑長度4.230、聚類係數0.657、模組性指數0.551（大於0.4時說明具有模組結構），這些引數均高於隨機網路：平均路徑長度2.257、聚類係數0.0995、模組性指數0.241。這表明微生物網路由緊密聯絡的節點組成，並形成了一種“小世界”的拓撲結構。網路圖中的節點主要分屬於11個門：Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Chloroflexi是主要的五個門，佔所有節點的90%。這些節點共形成了4個主要的模組。不同模組中的節點可能發揮不同的功能，且存在強烈的生態聯絡。在模組I中，許多節點的微生物參與電子轉移過程。模組II中大部分類群參與生物地球化學的碳、氮迴圈過程，模組IV中的大部分微生物參與有機汙染物的降解過程。因此，石油汙染土壤微生物群落中存在複雜的生物學過程，共發生模式是非隨機的且受微生物功能驅動。

圖5. 共發生網路分析，節點的大小表示相對丰度，邊的厚度表示相關性大小。（A）根據門對節點著色；（B）根據模組對節點著色

小結

本研究分析了五個地區石油汙染土壤中環境因子和空間距離對微生物群落構建的影響。pH、總石油烴、總氮、鎘含量能顯著影響微生物群落構建，微生物α-多樣性與pH呈正相關關係而與總石油烴呈負相關關係。在所有樣點中，微生物群落的相似度隨著地理距離的增加不斷減少，且微生物群落構建受空間距離和環境因子的共同驅動，而空間距離單獨解釋的微生物群落差異比環境變數大。微生物的空間分佈表明擴散相關的過程驅動微生生物地理分佈。通過網路分析，作者確定了五個關鍵類群包括Rubrivivax、Nitrospira、Methylotenera、Methyloversatilis和Acidaminobacter，且微生物共發生模式是非隨機的，受微生物功能驅動的。結果也表明不同地區的土壤，經過長時間的石油汙染，也會形成組成相同且可能功能也相同的微生物類群。

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