Establishing Causality: Opportunities of Synthetic Communities for Plant Microbiome Research 建立因果關係：合成菌群在植物菌群研究中的機會 Cell Host and Microbe [IF:17.872] 2017-08-09 Perspective DOI: https://doi.org/10.1016/j.chom.2017.07.004 第一作者：Julia A Vorholt 通訊作者：Julia A Vorholt 其它作者：Christine Vogel,Charlotte I Carlström,Daniel B Müller

熱心腸日報

Cell子刊：合成菌群在植物菌群研究中的機會 ① 討論解決菌群原位互作的遺傳複雜性的還原論方法，其目標是解析參與菌群組裝、動力學、快速恢復/耐受、建立菌群與植物表型之間的因果關係的生物學機制； ② 利用自下而上的方法選定構成合成菌群的混合菌株，在實驗上易於操作，可檢驗無菌系統的靶向操作的假說，產生可轉化為農業應用的知識； ③ 菌群、宿主和環境引數的修飾，可動態、空間維度上定量評估宿主和細菌的特徵。 主編評語：這是Cell Host & Microbe[IF：14.946]發出的關於如何利用混合不同菌株的“合成菌群”以促進植物菌群研究的觀點文章，立足於植物，但對其他菌群，包括人類腸道菌群的研究也有啟發意義。

前言

摘要

近年來，隨著植物微生物組學的研究更加深入，更加強調了微生物群落對植物生長以及健康等方面的重要作用。植物微生物組學的研究目的在於發現植物與微生物之間，微生物與微生物之間互作的分子機制，從而更加深入理解微生態系統乃至整個生態系統的功能。在這篇綜述中，作者討論了微生物在原生態位相互作用模式太複雜，很難在實驗條件下進行研究這一重要問題，以及解決這一問題的簡化方法。在人為可控的條件下進行人工模式群落的合成，就可以在動態層面上對植物和微生物作用特點進行定量評估。這篇綜述總結了這一新興領域的研究進展，以及現在相關研究的機遇與挑戰。並在多個層面上探究植物與微生物互作的重要功能，進一步強調了微生物組學在生物學領域的重要地位。

圖1 植物微生物組學的研究層面

1.最上層代表生物層面，表示植物，微生物以及與植物相關的微環境。 2.中間層代表巨集基因組層面，包括植物以及所有微生物的組學資訊。 3.最下層是生物有機體的分子層面，包括巨集轉錄組，巨集蛋白組，巨集代謝組方面的資訊。 實驗條件下可控的研究也應該從多個層面進行展開，並且需要考慮生物以及非生物的環境因素。

1.植物微生物組

隨著二代測序技術的快速發展，不同宿主的微生物群落研究已經進入了新紀元。已經有多個研究關注不同群落裡中相對丰度較高的物種。例如，==在人體腸道中丰度最高的細菌為厚壁菌門和擬桿菌門，而在擬南芥中則為變形菌門，放線菌門，擬桿菌門和厚壁菌門==。Muller等在2016的一篇綜述中說明有些微生物的出現只是由於隨機事件，而核心的微生物群落應該是在不同時空條件以及不同健康植物有機體之間，都能保持一定的穩定性和重複性。最近的一些研究發現，微生物群落的組裝過程不是隨機的，而是每年都按照相似的模式進行組裝。 植物相關微生物組是與植物的表型息息相關的。已經有研究例項證明，植物相關微生物組在保護植物免受病原侵害，大量元素的獲取，耐乾旱與耐鹽鹼，植物花期方面都有主導作用。由於這些表型都與植物健康相關，所以Theis等提出了這樣的假設：植物已經進化出富集和保持其相關微生物組的功能，並能調控其相關微生物組的行為，並且植物和相關微生物組存在著共進化。 植物自身免疫系統不止在於幫助植物抵抗病原，也與有益微生物的感應相關，因此免疫系統也是形成植物相關微生物組的一個初步篩選方式。反過來，微生物對植物的的免疫系統也存在調節作用。一些植物激素，例如水楊酸，茉莉酸，乙烯都可以作為調節微生物群落的效應因子。但是以往的研究僅僅關注了少數特定的病原，以及有限的有益微生物，例如熒光假單胞菌。因此，今後的研究很有必要進行延伸，考慮不同的植物表型，例如植物營養獲取，以及整個微生物群落。 Leach等2017年在Cell的一篇綜述中提出==phytobiome的概念：即研究植物系統時，不止考慮植物及其相關的微生物，還要考慮病毒，食草動物，環境因子等因素。==

圖2 植物微生物組研究中人工重複群落的概念

人工合成/重組群落的菌株來自於植物材料。基於不同的科學問題，通過由細節到整體的考察，進行人工群落中微生物的選擇，並接種於特定基因型的植物上，生長在實驗可控的條件下。總而言之，人工合成群落的方法可以幫助人們更加深入的理解微生物組的功能，並且可以為新型的農業生物製劑提供基礎。

2.構建人工群落的目的與挑戰

目前關於微生物組的研究很大一部分都停留在高通量測序以及資料的關聯性分析的水平上，這就導致關於微生物群落的組裝，動態過程，抗逆性產生的原因等方面的研究還不清晰。所以，要深入解決微生物組的問題，就需要設計一個條件在實驗室條件下可控的微生物模式群落。可控因素可以包括：某種特定的微生物是否存在，是否對某種菌或對植物進行基因改造，植物生長條件如土壤型別，溼度等。當這些條件達到可控時，就可以找出植物的基因型，微生物的基因型，以及環境因子的之間的因果關係。 為了清楚的解釋科學問題，人工群落需要依據實驗目的進行嚴格的設計。設計時需要定量考慮群落的組成及成分的相對丰度，全部的基因組資訊，在轉錄或蛋白表達水平上的基因表達資訊，和次級代謝產物，不同尺度上的環境因素。 人工設計植物相關微生物組可以考慮一些已經有全基因組資訊的植物，例如擬南芥，水稻，玉米，大豆等。當然，人們還是希望可以獲得一個模式的微生物群落可以用於各個系統中。實驗條件下的植物微生物組系統一方面可以揭示微生物群落間的相互作用關係，也可以找出在群落中起關鍵作用的核心物種。例如 van der Voort et al. 在2016年在抑制病原真菌Rhizoctonia solani的土壤中找出了起關鍵作用的細菌群落。

圖3 低、高複雜性人工群落的優勢和侷限性：

a. 低複雜性的群落（由1-10個微生物組成）：具有更高的可重複性和操作性，但是有可能缺少自然群落中的關鍵物種或功能物種。 b. 高複雜性的群落（由多於100個微生物組成）：可以模擬自然環境，維持群落的多樣性，仍具有較高的可操作性。 c. 生態學分析：最大化的還原自然的微生物多樣性，可以進行相關性分析，但是可能無法進行實驗證明。

3.菌株獲得以及無菌植物種植

高物種多樣性的菌株獲得是構建人工群落的基礎。如何保證選擇的菌株能夠更大程度上的代表自然環境是個關鍵問題，在實際操作中，我們可以用擴增子測序得到的樣品中OTU作為一定的參考，巨集基因組測序也可以提供一定的物種資訊。儘管有許多生信分析的手段，但想構建一個能夠代表自然環境真實微生物群落還是要儘可能的去分離和培養物種多樣性高的微生物類群。使用多種培養基，包括模擬植物的培養基，以及一些特殊的寡營養的培養基，梯度改變營養物質的濃度，可以增加可培養微生物的種類。微流控技術的發展使微生物共培養成為可能，這樣就可以獲得一些共生以及互生物種。 更重要的是菌株的獲得應該來自不同植物組織，例如葉，根，花，種子，也要來自不同的植物品種，還要來自不同的植物生長條件，比如不同的氣候。目前為止，研究者對微生物菌株的分離，培養時只關注細菌，然而為了更加科學的說明問題，微生物的獲得應該包括真菌，卵菌，對於某些特定植物可能還要包括古菌，這樣才能全面反映植物相關微生物的多樣性。 獲得更多的菌株不僅可以與自然微生物群落更加相似，進行合成微生物組學時大量的菌株還可以篩選新的天然產物。研究微生物與微生物之間的作用還可以探究不同微生物的生態位分化，而微生物與植物的互作還可以幫我們理解微生物協助宿主植物抗病，促進植物生長等方面機制。此外，我們在獲得可培養的微生物菌株時最好對其中的新物種進行基因組測序，以幫助我們進行功能的評估。除了考慮單菌的基因組，微生物群落的巨集基因組資訊對於研究基因與表型的關係也十分重要。 為了更好的研究植物與微生物組的互作，需要一個更加完善的無菌系統。已經有一些模式的無菌系統用於研究實驗條件下植物的培養和植物與微生物的互作，這些系統包括含瓊脂培養基的組培瓶(Magenta boxes), microboxes 和多孔板/細菌培養板，以及含有土壤有機質的黏土，或者高壓蒸汽處理的土壤。為了更好的模擬自然環境，還有儘可能多的考慮自然條件，例如光強度，紫外線輻射，溼度，植物密度，使這些條件儘可能與自然環境相似。

4.微生物組的設計

綜合性的合成群落應該包括多種組分。低複雜性的群落有利於研究其中每種組分所起的作用，但是，這樣的群落可能會導致一些自然環境中存在的網路中節點微生物的缺失。群落的複雜度提高可以更大程度的模擬自然環境,雖然高複雜性的群落也可能會缺少一些關鍵元素，但也可以相對說明問題。為了包括更多的組分，可以用環境樣品16S,18S rRNA基因測序結果作為參考，雖然把可檢測的OTU轉化為可培養的菌株還存在一些問題。比如與植物密切相關的Pseudomonas屬的細菌，由於植物基因型的不同，這個屬內同一物種的不同菌株有的可能對植物具有有益作用然而有的卻對植物起著有害作用。所以我們不能僅僅依靠這些物種的系統分類地位就對其生理功能進行定性，我們還需要對屬於同一分類單元的不同菌株進行單獨的功能驗證。不同於依賴系統分類地位進行人工菌群重建，研究者還可以依靠相應菌株的功能基因組資訊來篩選菌株，例如在人類腸道微生物研究中發現，沒有一個類群的微生物能在所有的腸道樣品中找到，說明腸道微生物組的功能不僅僅是被物種定義的而是被共享的基因和功能決定的。其它潛在人工功能菌群的篩選還包括是否促進植物生長，是否增強植物營養獲得以及幫助宿主抵禦病菌侵染等。 在構建人工微生物群落時需要注意這些問題：

1. 這些菌株之間是否相互拮抗？
2. 這些菌株是否能在液體或者固體培養基上生長？
3. 用於實驗的菌株生長週期多長？所有菌株是否按等比例混合，如果是應該怎麼精確測定？
4. 這些菌株應該如何接種到植物上？ 這些問題都將導致結果大不相同，所以為了保證實驗的可重複性，必須所有技術手段都要保證精確和一致。 圖4 植物微生物組學研究中群落重建實驗考察的因素 1.基於系統發生關係：例如這些群落是否在不同地區，不同宿主基因型的條件下都穩定存在 2.基於OTU聚類 3.基於相互作用網路：例如網路分析中的節點微生物 4.基於功能：例如考慮對宿主植物有益的功能

   5.分析和解讀植物微生物群落的功能

   深入理解植物微生物組需要多層面的分析手段，包括：相對丰度和絕對丰度；空間分佈格局以及分子分析手段。在一個低複雜度的微生物群落中，可以通過平板計數的方法進行人工微生物群落定量，但這種方法不適用於高複雜度的微生物群落。通過16S 擴增子測序可以揭示微生物的相對丰度，但無法得知每種菌的絕對丰度。對於16S基因拷貝數的問題，可以通過已經測序的細菌物種的全基因組資訊進行校正。此外作者例舉了一些對人工群落資料分析的方法，例如擴增子測序，巨集基因組測序，基於熒光單細胞分選來分析動態過程，定量PCR等。 全基因組關聯分析已經廣泛用於植物基因型和表型的關聯研究，未來巨集基因組關聯分析將建立揭示特定菌株與植物表型關聯的橋樑。微生物生態模型對於我們理解微生物群落的動態變化非常重要。然而建立微生物群落結構的數學模型來預測微生物功能仍然面臨巨大的挑戰。微生物與微生物以及宿主之間的互作關係可以用許多方法進行預測，包括關聯分析，本地相似度分析，貝葉斯網路分析等。共存網路分析能用於連續生態結構預測，包括代謝互作，群落抗性和穩定性以及鑑定核心物種和核心基因。

   6.用於植物有益表型的微生物組工程

   土著微生物群落對宿主植物有著重要的影響：例如營養狀況，生物量的積累以及對生物或非生物脅迫的抗性。因此，可以通過選擇特定的微生物群落來人工重建微生物群落，以獲得具有優良特性和服務於植物健康及生長的微生物群落。雖然作為在實驗室條件下進行的微生物群落的選擇才剛剛發展，但它基於宿主植物表型的自然選擇，已經在幾千年前的原始社會的農業生產中就已經開始運用了。最重要的原則是基於植物表型的選擇。Swenson等人首選運用這一原則，依據植物生物量和pH來篩選植物微生物組工程菌。最近Panke-Busse等人發現此方法選擇的微生物可影響植物開花時間和發育。 我們需要使用盡可能多的微生物培養方法和手段來獲得更多的微生物類群。儘管我們在分離培養時可能遺漏了植物微生物組的某些特定微生物類群，通過我們可以通過高通量測序對人工合成的微生物群落進行重新測序來幫助我們揭示與植物表型改善的微生物作用機制。人工微生物群落構建實驗可以精確跟蹤微生物群落結構的變化，為揭示微生物組基因型與植物表型之間潛在的因果關係提供新的科學手段。

   7.人工微生物群落構建的初步探究

   目前使用人工合成群落研究植物微生物組仍處於起步階段。然而，這個領域將會由於大量微生物基因組的測序以及大量微生物菌株的獲得而快速發展。Bodenhausen建立了由七個菌株組成的簡單合成群落，用於研究擬南芥葉際微生物群落的組成是如何隨擬南芥基因型的變化而變化。人工合成微生物群落也被用於揭示自然界中複雜的微生物與植物互作關係，例如，Lebeis等人通過構建由38個不同細菌構成的微生物群落來研究植物免疫對適當的根微生物群建立的影響。他發現擬南芥水楊酸訊號的傳導能顯著影響擬南芥根微生物群的組裝。此外他們還發現在一個由35種細菌構成的微生物群落中，在磷飢餓條件下下，人工菌群增強了PSR，PHR1和PSR轉錄調節因子的活性，並且PHR1不僅激活了這些條件下磷酸鹽脅迫反應的基因，而且直接抑制了植物免疫基因的表達，從而在植物營養和免疫之間建立了分子聯絡。 牛犇等人通過構建由7個不同物種構成的微生物群落實驗表明，E. cloacae在這個簡化的微生物群落組裝中至關重要。在沒有E. cloacae的情況下Curtobacterium pusillum物種丰度增加，而其他物種則在群落中消失，這表明E. cloacae是這7個物種構成的簡化微生物組中的核心微生物。此外，作者證明這7個物種構成的簡化微生物組比單獨的每個物種構成的微生物群落能更好地抑制Fusarium verticillioides病原菌。 Hu等人研究發現在自然土壤中生長的番茄根際加入8中不同假單胞菌群落，比加入單種假單胞菌物種抑制細菌青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）的效果更好。作者推測這可能是由於高多樣性的假單胞菌群落加劇對營養物質的競爭來抑制病原菌對宿主的侵染。總之，這些人工微生物菌群的構建研究證明了人工微生物菌群用於研究微生物與微生物互作以及與宿主互作的潛力，並且為研究者提供了將人工菌群與環境因子聯絡起來的第一途徑。

   結論

   由於其生物體系的複雜性，目前對影響微生物群落的形成因素的理解還不深入。基於人工微生物群落的研究，可用於揭示微生物互作的機理，以及決定植物相關微生物群落結構與功能的因素。人工重建的微生物群落並不是要完全替代環境方面的研究，而是通過一個實驗條件下可控的系統，來研究某些實驗現象更深入的機制。當實驗條件下可以深入理解某些機制後，也就具有了應用於溫室和田間試驗的潛力。人工模式微生物群落為研究植物的一些表型產生的原因確立了基礎，它可以在多個層面上進行植物微生物組的研究。還可以補充進行對某些特定微生物和植物的基因修飾，來研究不同組分之間的相互作用。在作物育種方面，也可以培育一些可以篩選特定有益微生物群體的品種，或者對植物增加與微生物互作的基因。最後，這項研究不僅可以幫助我們理解機理，還可以將這些知識應用到農業中，解決現在植物微生物組應用方面所遇到的問題，例如生防菌株的易變性。而且，使用合成群落作為生物製劑的新策略可以構建新一代的農業系統。

   Reference

   Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., & Mueller, D. B. (2017). Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe, 22(2), 142-155.