Thompson LR, Sanders JG, McDonald D, Amir A, Ladau J,Locey KJ et al (2017). A communal catalogue reveals Earth’s multiscalemicrobial diversity. Nature.

文章簡介：

我們對微生物世界的重要性和多樣性的認識日益增強，然而對它們的基本結構卻認知有限。近年來，基因測序領域取得了一系列新進展。但由於缺乏標準化的分析方法，常用分析框架又存在諸多缺陷，使微生物組的研究受到了一定限制，進而制約了人們對環境微生物基本結構的認知與發展。本文作者對地球微生物組計劃（EMP）中數百名研究人員收集的微生物群落樣本進行了元分析。相應的說明及新的基於精確序列而非OTU聚類的分析方法，將增強多項研究中對於細菌和古菌的核糖體基因序列的分析，並將多樣性的探索推向前所未有的規模。其結果為進一步深化微生物組研究作出了有益嘗試：一是建立了環境微生物基因序列參考資料庫，為深入研究未知環境的微生物組構成提供了資料基礎和參考依據; 二是建立了微生物基因資料框架，為優化完善地球微生物多樣性的描述模式做出了積極探索。

方法介紹：

1.樣品收集

EMP向全球科學界徵集環境樣本和相關資料，跨越不同的環境，不同空間、時間和物理化學共變。來自97個獨立研究的27751個樣本代表了不同的環境型別(圖a)、地理位置(圖b)和化學反應。所有樣品進行了DNA提取和測序，並對在整個資料庫的細菌和古菌部分進行了分析。

圖1. 環境型別和樣品來源。
a. 地球微生物組計劃本源(EMPO)分為三級；從低到高分別為微生物環境(level3)、動植物和土鹽分(level2)、自由生物與宿主相關(level1)。共使用23828個高質量樣品，詳細方法見網址：http://www.earthmicrobiome.org/protocolsand-standards/empo

2.DNA提取，PCR擴增，測序和序列預處理

1).DNA 提取使用 MO BIO PowerSoil DNA extraction kit試劑盒。

2).PCR擴增使用16SrRNA V4區域上的配對引物的515F-806R。

3).測序使用Illumina HiSeq或MiSeq測序平臺。

4).測序所得資料使用QIIME 1.9.1 script split_libraries_fastq.py拆分序列並以預設引數進行質量控制隨後生成FASTA序列檔案。

3.序列標記、OTU篩選以及群落分析方法

考慮到與植物相關的樣本以及無宿主影響的樣本中，三分之一及以上的序列不能與現有的rRNA資料庫匹配，該研究中使用了一種無需參考序列的方法，Deblur，來去除錯誤的序列並提供了單核酸精度上的sOTU（sub-OTU）,該文章中稱為“標記序列”（tag sequence）。由於早期EMP計劃中的測序長度為90bp，為了將不同時期的序列結果統一起來，進行比較，該研究將所有的序列都切除到了90bp，相應的結果也輔助說明了90bp，100bp和150bp等不同長度不影響研究結果。在與參考資料庫（Greengenes 13.8 和Silva 128）的全長序列進行比對時，使用VSEARCH工具來全域性比對，並要求100%相似性。

對於90bp的Deblur結果，每個樣本均隨機抽取了5000個觀測到的序列進行分析微生物群落的alpha多樣性（observed_otus, shannon, chao1, faith_pd）和beta多樣性（基於UniFrac距離矩陣，進行PCoA分析）。

16S rRNA基因拷貝數的計算：基於PICRUSt 1.1.0的命令列指令碼“normalize_by_copy_number.py”，將每一個OTU的丰度除以相應推測出的16S rRNA基因的拷貝數。

隨機森林的方法對樣本進行分類分析：針對Deblur 90 bp 結果中2000個樣本，使用隨機森林分類樹的方法，將不同環境下的樣本劃分至相應的環境標籤中。在方法中使用了R語言下的caret和randomForest包。

SourceTracker分析來確定tag sequence在多個環境樣本中的分佈程度。該分析利用Source Tracker 2.0.1來完成。在分析之前，每一個樣本的序列總數均稀釋至1000。

Deblur演算法簡介：

1). 將樣本中序列進行統計個數並由大到少依次排列，依次記錄reads ri，counts ci，i = 1，2，…Nreads，ci依次遞減。以i =1為例，假設 c′1 為 r1 在初始樣本中的真實個數，由於測序過程中的一些錯誤，c′1 < c1，α是測序過程中出現錯誤的平均概率，為了得到的 r1 的真實個數，進行以下計算：c′1 =c1/(1-α)

2). 在增加c1之後，需要降低相應的其餘序列的個數，因為在該演算法中，假設r1測到的真實個數降低，是由於被誤測成了其餘序列。因此這裡選用在不同Hamming距離（即mismatch，dik）下的錯誤率 β(dik) 來估計其餘序列被測成r1的個數，以此來校正不同序列在測序過程中的真實個數。以 rk 為例，1 < k< Nreads,被誤測成r1的序列的個數應該是：ck = [1-β(dik)]c′1

3). 重複上述過程，i = 1, 2,…Nreads，i < k< Nreads，依次校正各條序列的真實個數。

備註：不同mismatch下的錯誤率是基於多個Miseq和Hiseq測序結果的收集起來的統計值。

4. 多樣性分析

通過Greengenes資料庫建樹、UniFrac距離計算，用QIIME進行alpha-多樣性（圖a）分析，richness與緯度、pH和溫度的相關性，beta-多樣性（圖c）的分析，以及16S rRNA基因平均拷貝數的計算（圖d）。

圖2. Alpha和Beta多樣性，以及預測的16S rDNA拷貝數。
a. 群體內Alpha多樣性觀察長度為90-bp序列的豐富度，共有23828個生物為獨立的樣品。抽樣至5000條序列，黃線為組均值，發現自由生活環境比宿主依賴的多樣性高；
b. 不同pH值和溫度下多樣性變化，存在單峰分佈的規律，即多樣性先升高，再降低；
c. 按level2/3分組上色展示PC1對應PC2/3平面上樣品間距離分佈；
d. 不同群體中16S基因拷貝數在level2/3水平分佈。

5.用更為精確的分類單元代替OTU聚類。

微生物生態不再需要OTU聚類，而是一個更為精確的分類單元。這樣一來，序列的特異性更高，環境分類也可以更細，使我們能夠在更精確的解析度下觀察和分析微生物分佈模式。在該文章中，作者以shannon熵值為標準，分別對tag sequence和較高的物種分類在不同環境中的分佈進行分析。可以看出，新方法中的標記序列對環境具有較高的特異性，分佈偏向於一個或幾個環境(低Shannon熵)；相比之下，更高的物種分類學水平往往更均勻地分佈在不同的環境(高Shannon熵，低特異性)(圖a)。不同物種分類級別上的所有標記序列的熵的分佈也證實了這一觀點(圖b) 。為了精確衡量每個分類單元對環境的差異，作者也探究了熵隨著生態系統距離的變化而變化的模式(圖c)。

圖3. 巢式群體組成(展示大樣本中物種分佈規律的好方法)。
a. 樣品間出現或缺失門，x軸按豐富度排序 ，Y軸按門相對丰度排序。
b. 與a相似，只是分為動、植、鹽、非鹽四類環境下門有無的分佈；
c. 評估各級別不同環境中物種的多樣性。

圖4. 環境中精確序列和屬水平分類結果比較。
a. 環境中分佈的屬和400個隨機的序列相對丰度分佈，顏色標註為分類level3。
b. 不同分類級別的夏農熵分佈箱線圖；
c. 最大進化樹上點對點距離與夏農熵關係

結論：

利用精確的序列代替OTUs，可以揭示微生物生態學的基本生物地理模式，其解析度和範圍可以與目前用於巨集觀生態學的資料分析相匹敵。其結果指出微生物群落的真正原理，可以進行環境特異性更加顯著的16S rRNA序列分析。

中國科學院生態環境研究中心

環境生物技術重點實驗室

鄧曄 研究員課題組釋出

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