啟動子的分析和預測
啟動子的分析和預測
一、摘要
- 加深對基因啟動子的理解和認知；
- 學會如何獲取已知基因的啟動子序列資料；
- 熟悉不同啟動子分析軟體的使用及其適用範圍；
- 學會設計啟動子克隆引物。
- 熟悉EPD和TransFac資料庫的使用；
- 學會使用已知的啟動子和轉錄因子TransFac的HMM模型，並能夠獨立程式設計，利用該HMM模型來計算鑑別未知啟動子
二、材料和方法
1、硬體平臺
處理器:Intel（R） Core（TM）i7-4710MQ CPU @ 2.50GHz
安裝記憶體(RAM)：16.0GB
2、系統平臺
Windows 8.1、Ubuntu
3、軟體平臺
【1】Primer-BLAST
【2】Softberry系列工具
【3】Promoter 2.0
【4】BDGP
【5】Cister
【6】NEBcutter
4、資料庫資源
NCBI資料庫：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
UCSC資料庫：http://genome.ucsc.edu/
5、研究物件
人類谷胱甘肽硫轉移酶M1的promoter區域
三、結果
基因啟動子序列的獲取
選擇基因：谷胱甘肽硫轉移酶M1(GSTM1)
概況：當攜帶風險基因型時，對環境毒素和致癌物質的敏感性提高，易發生DNA突變和染色體畸變，患白血病的風險因而顯著增加。
首先進入UCSC genome browser 檢視GSTM1上游5kb範圍內有無其他基因。發現該基因的上游存在同一家族的GSTM2，所以promoter大概只有3kb。
圖表 1UCSC genome browser
接下來進入Genbank，搜尋GSTM1，檢視該基因在基因組中的定位和基因結構。
圖表 2檢視基因定位和結構
開啟該基因的序列資訊，獲取該基因的啟動子序列（包含exon1）
Neural Network Promoter Prediction
進入BDGP: Neural Network Promoter Prediction網站http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html，進行啟動子預測
圖表 3 BDGP: Neural Network Promoter Prediction網站
一共預測出來3個啟動子(這個網站預測出來的promoter都是50bp)
圖表 4 BDGP預測結果
Promoter 2.0 Prediction
使用Promoter 2.0 Prediction Server http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/
進行啟動子預測，也是一共預測出來3個啟動子
圖表 5Promoter 2.0預測結果
Softberry預測
TSSW、TSSP、TSSG、FPROM都是softberry提供的啟動子預測工具，進入
官網(http://www.softberry.com/)，然後點選service即可，啟動子預測工具網址：
http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=index&group=programs&subgroup=promoter
TSSW
TSSW具體網址如下(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=tssw&group=programs&subgroup=promoter)，輸入序列進行預測即可。TSSW並沒有預測出來promoter區域。
圖表 6TSSW預測結果
TSSP
TSSP具體網址如下(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter)，輸入序列進行預測即可。共計預測出來一個promoter區域。
圖表 7 TSSW預測結果
TSSG
TSSG具體網址如下(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=tssg&group=programs&subgroup=promoter)，輸入序列進行預測即可。TSSG並沒有預測出來promoter區域。
圖表 8TSSG預測結果
FPROM
FPROM具體網址如下(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=fprom&group=programs&subgroup=promoter)，輸入序列進行預測即可。FPROM並沒有預測出來promoter區域。
圖表 9FPROM預測結果
Cister
Transcription Elements預測平臺：Cis-element Cluster Finder
https://zlab.bu.edu/~mfrith/cister.shtml
由於序列只有3kb，預設引數預測出來的轉錄元件太少，將average distance between clusters引數由預設的3w修改為3k，最有可能的結果還是NF-1
圖表 10Cister預測結果
Match
轉錄因子預測集合網站http://gene-regulation.com/pub/programs.html (需要註冊)
具體網址http://gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/match/bin/match.cgi
圖表 11Match預測結果
AliBaba 2.1
轉錄因子預測集合網站http://gene-regulation.com/pub/programs.html (需要註冊)
具體網址http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html
預測出來一大堆，下面僅擷取其中一部分。
圖表 12AliBaba預測結果
基因結構繪圖
雖然使用了6個promoter預測線上平臺，但是隻有3個平臺預測出promoter。
利用線上平臺processon繪製基因結構圖
圖表 13基因結構圖
接下來大致將預測結果分為4個區域，將引物設計的範圍同時繪製出來（箭頭為引物）
PrimerBlast引物設計
圖表 14引物結構
先使用預設引數進行嘗試，設定好Forward primer和Reverse primer的Range，再將PCR product size最大值調成整段序列的長度3005，同時# of primers to return引數調整為1，以方便截圖。
圖表 15引物位置
圖表 16初步設定引數
然而由於有重複序列，經過repeat filtering，不會跑出來引物，只能將引數調寬鬆。
圖表 17預設引數結果
在Advanced parameters的Primer Parameters欄目，將Repeat filter關掉，同樣可以看出來GC含量和TM值也篩選掉很多引物，在Internal hybridization oligo parameters欄目，將引物內雜交的引數調整寬鬆。
圖表 18高階引數調整
引物設計結果：
圖表 19第一段
圖表 20第二段
圖表 21第三段
圖表 22第四段
第一段：
| · | Sequence (5’->3’) | Template strand | Length | Start | Stop | Tm | GC% | Self complementarity | Self 3’ complementarity |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Forward primer | TCGTACCTACCCTCTGTTCGT | Plus | 21 | 164 | 184 | 60 | 52.38 | 4 | 0 |
| Reverse primer | GGGCTGCACTCAGTAAGACT | Minus | 20 | 2918 | 2899 | 59.39 | 55 | 5 | 3 |
第二段：
| · | Sequence (5’->3’) | Template strand | Length | Start | Stop | Tm | GC% | Self complementarity | Self 3’ complementarity |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Forward primer | CCAAGTGCCCCAACTTAGCA | Plus | 20 | 849 | 868 | 60.54 | 55 | 4 | 0 |
| Reverse primer | GGGCTGCACTCAGTAAGACT | Minus | 20 | 2918 | 2899 | 59.39 | 55 | 5 | 3 |
第三段：
| · | Sequence (5’->3’) | Template strand | Length | Start | Stop | Tm | GC% | Self complementarity | Self 3’ complementarity |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Forward primer | CCAGGCGTCACTAACACAGG | Plus | 20 | 1522 | 1541 | 60.67 | 60 | 3 | 1 |
| Reverse primer | GTTCCGGGAGCGAAGTCAG | Minus | 19 | 2874 | 2856 | 60.45 | 63.16 | 5 | 1 |
第四段：
| · | Sequence (5’->3’) | Template strand | Length | Start | Stop | Tm | GC% | Self complementarity | Self 3’ complementarity |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Forward primer | CGAGGGCCCCTAACAGAAAA | Plus | 20 | 2405 | 2424 | 59.67 | 55 | 7 | 0 |
| Reverse primer | CTGGGGCTGCACTCAGTAAG | Minus | 20 | 2921 | 2902 | 60.39 | 60 | 5 | 3 |
NEBcutter酶切位點分析
使用NEBcutter分析該啟動子序列，為了更加全面，查詢全部的特異性位點Enzymes to use: All specificities
http://nc2.neb.com/NEBcutter2/
儲存沒有酶切位點“0 cutters”的核酸內切酶資料，見附錄。
圖表 23NEBcutter結果
pGL4.17載體
查詢pGL4.17的載體資料，獲得酶切資訊。查詢關鍵詞：promega pGL4.17。
圖表 24pGL4.17載體資訊
其中SfiI、Acc65I、KpnI、SacI、NheI、XhoI、EcoRV、BglII、HindIII這九個酶都屬於在promoter內部沒有酶切位點的，這些都可以選用。
引物設計
從上面九個酶中隨便選兩個（真實情況要考慮到切割率等問題）
選擇KpnI和SacI，下面是酶切位點和保護鹼基對應表，KpnI選兩個保護鹼基。
可以看出來酶切位點序列在反向互補以後和原序列相同，直接把這段序列加在引物前面就成。
最後按照“保護鹼基+酶切序列+PCR引物”的順序，設計用於可以轉到pGL4.17載體的引物。
| · | 164..184–2918..2899 | 849..868–2918..2899 | 1522..1541–2874..2856 | 2405..2424–2921..2902 |
|---|---|---|---|---|
| Forward Primer | CGAGCTCTCGTACCTACCCTCTGTTCGT | CGAGCTCCCAAGTGCCCCAACTTAGCA | CGAGCTCCCAGGCGTCACTAACACAGG | CGAGCTCCGAGGGCCCCTAACAGAAAA |
| Reverse Primer | GGGGTACCGGGCTGCACTCAGTAAGACT | GGGGTACCGGGCTGCACTCAGTAAGACT | GGGGTACCGTTCCGGGAGCGAAGTCAG | GGGGTACCCTGGGGCTGCACTCAGTAAG |
後續實驗流程
接下來，用這四組引物，把四個promoter區域PCR出來，順帶PCR出來的還有保護鹼基和酶切序列，匯入pGL4.17，用雙熒光素酶報告系統看看哪兒個promoter活性最高，大概會出來下面這種圖，後面那張圖明顯說明promoter3活性最高。
再接下來，還可以用TFSEARCH，TFBSs，TRED這樣的轉錄因子預測軟體（上面也做了幾個預測），看看活性最高的那段區域和哪兒些轉錄因子相關，或者用pubmed查檢視文獻，ENCODE，TRANSFAC等資料庫，查詢這個基因啟動子區域的轉錄因子資訊。
接下來是程式設計練習部分
HMM模型
TransFac是轉錄因子資料庫，但是好像需要註冊才能下載模型的矩陣。
從EPD真核生物啟動子資料庫下載脊椎動物TATA-box的矩陣（共計12位鹼基）。
網址http://epd.vital-it.ch/promoter_elements.php
利用該矩陣建立打分模型，對上面谷胱甘肽硫轉移酶M1(GSTM1)的啟動子序列進行分析，具體程式碼見附錄。
打分值：每次取出12bp序列計算，依次計算每位鹼基所佔比例，再累乘得到分值（由於數值太小，分值皆除以最大分值）
圖表 25打分值統計圖
P值計算：使用bootstrap方法，將12bp序列打亂1000次，再按照上述方法計算分值，如果1000次內有n次分值高於“打亂之前的分值”，則p值為n/1000
圖表 26 p值統計圖
看的出來，整段promoter區域大部分分值都為0，p值為1。之前線上預測軟體中的200,400,1200,2570這四個位置，此處也能預測出來，效果還可以。
附錄
”0 cutters”核酸內切酶
| Col1 | Col2 | Col3 |
|---|---|---|
| 1 | AatII | GACGTC |
| 2 | AbaCIII | CTATCAV |
| 3 | AbsI | CCTCGAGG |
| 4 | Acc65I | GGTACC |
| 5 | Acc65V | GACGCA |
| 6 | AclI | AACGTT |
| 7 | AfeI | AGCGCT |
| 8 | AflII | CTTAAG |
| 9 | AflIII | ACRYGT |
| 10 | AhyRBAHI | GCYYGAC |
| 11 | AjuI | (N)5(N)7GAA(N)7TTGG(N)6(N)5 |
| 12 | AleI | CACNNNNGTG |
| 13 | AloI | (N)5(N)7GAAC(N)6TCC(N)7(N)5 |
| 14 | AlwFI | GAAAY(N)5RTG |
| 15 | ApyPI | ATCGAC(N)18NN |
| 16 | AscI | GGCGCGCC |
| 17 | AseI | ATTAAT |
| 18 | AsiSI | GCGATCGC |
| 19 | AspDUT2V | GNGCAAC |
| 20 | Asu14238IV | CGTRAC |
| 21 | BaeI | (N)5(N)10ACNNNNGTAYC(N)7(N)5 |
| 22 | BamHI | GGATCC |
| 23 | BarI | (N)5(N)7GAAG(N)6TAC(N)7(N)5 |
| 24 | Bce3081I | TAGGAG |
| 25 | BceAI | ACGGC(N)12NN |
| 26 | BcgI | NN(N)10CGA(N)6TGC(N)10NN |
| 27 | BclI | TGATCA |
| 28 | BdaI | NN(N)10TGA(N)6TCA(N)10NN |
| 29 | BglII | AGATCT |
| 30 | BlpI | GCTNAGC |
| 31 | BmgBI | CACGTC |
| 32 | BmtI | GCTAGC |
| 33 | BpuJI | CCCGT |
| 34 | BsaAI | YACGTR |
| 35 | BsbI | CAACAC(N)19NN |
| 36 | BsiEI | CGRYCG |
| 37 | BsiWI | CGTACG |
| 38 | Bsp24I | (N)5(N)8GAC(N)6TGG(N)7(N)5 |
| 39 | Bsp3004IV | CCGCAT |
| 40 | Bsp460III | CGCGCAG |
| 41 | BspDI | ATCGAT |
| 42 | BsrBI | CCGCTC |
| 43 | BsrGI | TGTACA |
| 44 | BssHII | GCGCGC |
| 45 | BstAPI | GCANNNNNTGC |
| 46 | BstBI | TTCGAA |
| 47 | BstEII | GGTNACC |
| 48 | BstZ17I | GTATAC |
| 49 | Bsu3610I | GACGAG |
| 50 | BtgZI | GCGATG(N)10NNNN |
| 51 | Cal14237I | GGTTAG |
| 52 | CcrNAIII | CGACCAG |
| 53 | Cdi11397I | GCGCAG |
| 54 | Cdi81III | GCMGAAG |
| 55 | CdiI | CATCG |
| 56 | Cgl13032I | GGCGCA |
| 57 | Cgl13032II | ACGABGG |
| 58 | ClaI | ATCGAT |
| 59 | Cma23826I | CGGAAG |
| 60 | CstMI | AAGGAG(N)18NN |
| 61 | DrdI | GACNNNNNNGTC |
| 62 | EagI | CGGCCG |
| 63 | EciI | GGCGGA(N)9NN |
| 64 | Eco53kI | GAGCTC |
| 65 | EcoRV | GATATC |
| 66 | Exi27195I | GCCGAC |
| 67 | FseI | GGCCGGCC |
| 68 | FspAI | RTGCGCAY |
| 69 | FspI | TGCGCA |
| 70 | GauT27I | CGCGCAGG |
| 71 | GdiII | CGGCCR |
| 72 | HindIII | AAGCTT |
| 73 | HpaI | GTTAAC |
| 74 | Hpy99I | CGWCG |
| 75 | HpyAXIV | GCGTA |
| 76 | Jma19592I | GTATNAC |
| 77 | Jma19592II | GRGCRAC |
| 78 | Kor51II | RTCGAG |
| 79 | KpnI | GGTACC |
| 80 | Lmo370I | AGCGCCG |
| 81 | Lsp6406VI | CRAGCAC |
| 82 | Maf25II | CACGCAG |
| 83 | MaqI | CRTTGAC(N)19NN |
| 84 | MauBI | CGCGCGCG |
| 85 | MkaDII | GAGAYGT |
| 86 | MluI | ACGCGT |
| 87 | MreI | CGCCGGCG |
| 88 | MslI | CAYNNNNRTG |
| 89 | MteI | GCGCNGCGC |
| 90 | NaeI | GCCGGC |
| 91 | Nbr128II | ACCGAC |
| 92 | NgoMIV | GCCGGC |
| 93 | NhaXI | CAAGRAG |
| 94 | NheI | GCTAGC |
| 95 | NotI | GCGGCCGC |
| 96 | NpeUS61II | GATCGAC |
| 97 | NruI | TCGCGA |
| 98 | PacI | TTAATTAA |
| 99 | PaeR7I | CTCGAG |
| 100 | Pal408I | CCRTGAG |
| 101 | PciI | ACATGT |
| 102 | PcsI | WCGNNNNNNNCGW |
| 103 | Pfl1108I | TCGTAG |
| 104 | PflFI | GACNNNGTC |
| 105 | PflMI | CCANNNNNTGG |
| 106 | PlaDI | CATCAG(N)19NN |
| 107 | PliMI | CGCCGAC |
| 108 | PmeI | GTTTAAAC |
| 109 | PmlI | CACGTG |
| 110 | PpiI | (N)5(N)7GAAC(N)5CTC(N)8(N)5 |
| 111 | PshAI | GACNNNNGTC |
| 112 | PsiI | TTATAA |
| 113 | PspXI | VCTCGAGB |
| 114 | PsrI | (N)5(N)7GAAC(N)6TAC(N)7(N)5 |
| 115 | Pst273I | GATCGAG |
| 116 | PvuI | CGATCG |
| 117 | RceI | CATCGAC(N)18NN |
| 118 | RdeGBI | CCGCAG |
| 119 | RpaB5I | CGRGGAC(N)18NN |
| 120 | RpaBI | CCCGCAG(N)18NN |
| 121 | RpaI | GTYGGAG(N)9NN |
| 122 | RpaTI | GRTGGAG |
| 123 | Rsp008IV | ACGCAG |
| 124 | RspPBTS2III | CTTCGAG |
| 125 | RsrII | CGGWCCG |
| 126 | SacI | GAGCTC |
| 127 | Saf8902III | CAATNAG |
| 128 | SalI | GTCGAC |
| 129 | SbfI | CCTGCAGG |
| 130 | SexAI | ACCWGGT |
| 131 | SfiI | GGCCNNNNNGGCC |
| 132 | SgrAI | CRCCGGYG |
| 133 | SgrDI | CGTCGACG |
| 134 | SnaBI | TACGTA |
| 135 | SpeI | ACTAGT |
| 136 | SphI | GCATGC |
| 137 | SpnRII | TCGAG |
| 138 | SrfI | GCCCGGGC |
| 139 | SsmI | CTGATG |
| 140 | Ssp714II | CGCAGCG |
| 141 | SstE37I | CGAAGAC(N)18NN |
| 142 | Sth20745III | GGACGAC |
| 143 | SwaI | ATTTAAAT |
| 144 | TaqIII | CACCCA(N)9NN |
| 145 | TspARh3I | GRACGAC |
| 146 | TssI | GAGNNNCTC |
| 147 | Tth111I | GACNNNGTC |
| 148 | UbaF12I | CTACNNNGTC |
| 149 | UbaF13I | GAG(N)6CTGG |
| 150 | UbaF14I | CCA(N)5TCG |
| 151 | UbaF9I | TAC(N)5RTGT |
| 152 | UbaPI | CGAACG |
| 153 | Xca85IV | TACGAG |
| 154 | XhoI | CTCGAG |
| 155 | ZraI | GACGTC |
模型矩陣
從EPD下載，儲存為data.txt
http://epd.vital-it.ch/promoter_elements.php
| Position | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A | 17.7 | 19.3 | 6.6 | 83.4 | 0 | 95 | 72.3 | 94.2 | 53.3 | 29.3 | 17.7 | 22.7 |
| C | 21.1 | 36.1 | 14.8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 32.5 | 33 |
| G | 29 | 36.4 | 6.8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5.8 | 20.1 | 51.2 | 37.7 | 33.2 |
| T | 32.2 | 8.2 | 71.8 | 16.6 | 100 | 5 | 27.7 | 0 | 26.6 | 10.5 | 12.1 | 11.1 |
R程式碼
setwd("G:/AllShare/genomicsHomework/HMMmodel")
hmmmodel<- read.table("data.txt",header = TRUE)
rownames(hmmmodel) <- hmmmodel$Position
hmmmodel <- hmmmodel[,-1]
hmmmodel <- hmmmodel/100
hmmmodel <- t(hmmmodel)
library(seqinr)
promoter<- read.fasta(file = "promoter.fa")
seqmatrix<- as.matrix(promoter$`NC_000001.11:109684796-109687800`)
# 轉成大寫字母
seqmatrix<- toupper(seqmatrix)
maxseq<- strsplit("TGTATAAAAGGG",split = "")[[1]]
# 計算打分值
computeScore <- function(seq){
score <- 1
for(i in 1:length(seq)){
score <- score*hmmmodel[i,seq[i]]
}
return(score)
}
# 使用bootstrap方法,計算p值
bootstrap<- function(seq){
flag <- 0
for(i in 1:1000){
tmp <- sample(seq)
score<- computeScore(tmp)
if(score>=computeScore(seq)){
flag <- flag+1
}
}
return(flag/1000)
}
maxscore<- computeScore(maxseq)
bootstrap(maxseq)
scorevector <- c()
pvaluevector <- c()
for(i in 1:(length(seqmatrix)-11)){
tmp<- seqmatrix[i:(i+11)]
score <- computeScore(tmp)
pvalue <- bootstrap(tmp)
scorevector <- c(scorevector,score)
pvaluevector <- c(pvaluevector,pvalue)
}
result <- data.frame(scorevector,pvaluevector)
result$position <- 1:(length(promoter$`NC_000001.11:109684796-109687800`)-11)
colnames(result) <- c("score","pvalue","position")
result$score <- result$score/maxscore
library(ggplot2)
ggplot(result, aes(x=position, y=score)) +
geom_line() +
geom_point(size=4, shape=20) +
labs(title="score by HMM model")+
theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5))
ggsave("HMM模型打分圖.pdf")
ggplot(result, aes(x=position, y=pvalue)) +
geom_line() +
geom_point(size=4, shape=20) +
geom_hline(aes(yintercept = 0.05),colour="red",linetype="dashed")+
labs(title="p value by HMM model")+
scale_x_continuous(breaks = c(0,200,400,1030,1200,1632,2570,2700))+
theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5))
ggsave("HMM模型p值圖.pdf")
序列
Promoter序列
>NC_000001.11:109684796-109687800 Homo sapiens chromosome 1, GRCh38.p7 Primary Assembly
TCTGCTCTTGAACCCTGTGTTCTGTTGTTTAAGATGTTTATCAAGACAATATGTGCACCACTGAACATAG
ACCCTTATCAGGAGTTCTACTTTTGCCTTTGTCCTGTTTCCTCAGAAGCATGTGATCTTTGTTCTGCTTT
TTGCCCTTTAAAGCATGTGATCTTCGTACCTACCCTCTGTTCGTACACCACCACCCCTTTTGCAATCCTT
AATAAAAACTTGCTGGTTTTGAGGCTCGGGCAGGCATCATGGTCCTACCGATATGTGATGTCACCCCTGG
CGGCCCAGCTGTAAAATTCTTCTCTTTGTACTCTTTCTCTTTATTTCTCAGCTGGCTGACACTTATGGAA
AATAGAAAGAACCTACGTTGAAATATTGGGGGCAGGTTCCCCAATAGCCTTGCTGAGGAAATTAAATTTA
TGTTCAAGTGCTATTTCTTTATGGCACCAAGGAACAAGTATTTCAAACAATACTAATGTAACAGTACTGG
TTCTATGTGTTTCAAAATTATTATTCTCATGAGTGTTAGCTTTCTTAAAAAATCGTTTTTTTTTTCAATT
GGATCTAGACATCTTATCTTTCACAGCTCAAGACGGATTAACTCAGAATCATAAACTCTTAATGCATAAT
GAGAAATATAATGTTTCCTAGGGCCAGGCACTTGTGTCTGTGCTGGTGCTATTGCCTCAATGCAGGAAAA
TCTATGTAAGAGTTCACTGTGAGGCCAAAACTGCTTCCTAAACATGGATACCTGCCAGGTATCTGAGCTG
GGAGTACTGCCCAGGTCTGGATGGGCGGGGAGTGTTTGCAACAAGGACTGTGCCTTGCCAGCCTCAGTGA
CACAGTGTCCAAGTGCCCCAACTTAGCAGCCACCTGCTGACCACCTGATTTCTGTGGCCTAATAGGGATG
TGATGAAGTCTACCTGTTTACTCAACCCCAAACCACACATTATCCAGGTGGTTTGAAACTTTTTTGATAT
ACTGGGTTCATCCTCTGGAGTCCTAACAATGTTTTAGCTAATTTACAAAAAACAAAACAAAACAAAACAA
AACAAAACAAAACAAAAAAACTACTTTTTTTGCAGCACAACAGCCTGGTTTACATTGCAAAATGATTTCT
CATTAAAGGTCTATCATCTATTTCCATATGTCCATTATTATTTGCAATATCCTTTAAAGCAGTCAACCCC
AGGCTAATCCATTGCACAACTCTTTTGAAAGTCTTCCTTCTACCTTGAAAGAAGAAAGTTGGCAGGTTGG
ACATTGTTCTCGTGGAGGTTGTACCATGGGTCACATATCACGGTGTGACTTCAAAGGCCACTGGAGCCAC
CGTCTCATACTGAAGAACACACATGGGTCAGGAGCCAGGTCCAGGTCCGGAATGGTGGATCTGGAGAGGG
GAGGGTCCCTGCCTGTGGTCCTGTGGGGAGCCCTCAGGCTCCTCTCTGGCCACCATCCTCTGACCTCCCT
CCTCAGCAGGACAGGGTTCTGGCTTCTCTGAGGGACAGGTTCTGTGGCAGGCCAGGCGTCACTAACACAG
GCCTCCATAACAACTGTTTCAGTACTGACTGAGTGGTGAAGTTAAATATTAAAAGCTGAAAAAAGCCAGT
ACCTTTATACAGAGGCTGGATGTAACAAAAGCCCACCAAGAGTTTTGCTTAGGCCTTTCCTGGGCCTTAA
AGCATGACAAAACAATGAAGGAATTCTTAACAGGACCTATTTAGAATTAAACAAGTTTTATTGTGAGTCT
GAAGAAACTCCCCAGGCCTCCACAAACAAGTTTATTGGGCGTCTGAAGGAACTCCCCAAACCTCCGTGAT
TTAGCAGGAGACAAGATAAGGGTAATCATCCCCCGCACCTGGACCCATTTAGATTAAATAAATAGACTGA
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