QIIME 2使用者文件. 3老司機上路指南(2018.11)

阿新 • • 發佈：2019-01-01

文章目錄

前情提要
老司機上路指南

為什麼要改用QIIME 2?

老司機上路前的幾點建議

資料處理步驟

資料匯入
樣本拆分
雙端合併
去除非生物序列
相似序列分組
去噪
OTU聚類
物種分類
分析特徵表獲得新發現
資料匯出

新的外掛
附錄1. 可匯入的重要資料格式
附錄2. 可匯入的重要資料型別
譯者簡介
Reference
猜你喜歡
寫在後面

前情提要

老司機上路指南

QIIME 2 for Experienced Microbiome Researchers

本節5365字，我們將介紹如何使用QIIME 2處理微生物資料。本節教程主要針對經驗豐富的微生物研究人員，即已經對如何處理資料非常熟悉，只需要知道的QIIME 2中特殊步驟的命令。

上一節我們的QIIME 2概述教程包含微生物資料處理的更多理論，本節將使老司機輕鬆上手QIIME 2。新人可跳過，或當學習資料閱讀(看看是否能讀懂，全看懂的才是老司機)。

為什麼要改用QIIME 2?

Why switch to QIIME 2?

對於習慣於使用自己的工具和指令碼處理資料、並且希望對過程中的每個步驟進行精細控制的使用者來說，轉換到QIIME 2可能是困難的(這好像是在説我)。我們理解經驗豐富的微生物研究人員令人抓狂的學習曲線，但是相信社群、開源的環境和對可重複科學的承諾，使得切換到QIIME 2時開始感覺有些沮喪是值得的。

通過為微生物組資料分析提供一個通用框架，QIIME 2彙集了一個充滿活力和包容性的社群。通過加入QIIME 2社群，作為一名正式的微生物學研究人員，您將自動與該領域的其他領導者產生聯絡，並且能夠更容易地一起工作，以推動微生物學研究的最佳方法開發和實施，以供廣泛使用。QIIME 2社群包括微生物學研究的老司機以及新手：鼓勵所有人蔘與並相互學習。QIIME 2論壇包含關於如何執行微生物資料處理和分析的大量資訊，以及關於該領域最佳方法具有建設意義的討論。

QIIME 2還鼓勵使微生物學研究更加可重複。QIIME 2通過定義特定的資料型別和僅將方法限制到其適當的資料輸入型別，以減少不適當的分析。它還跟蹤每個QIIME 2物件相關聯的資料起源和對給定資料檔案所做的所有操作。

此外，通過將工具封裝到一個常用框架中，形成了簡化的資料處理流程。使用QIIME 2大多數資料處理工作流可以合併成一個（或幾個）bash指令碼，從而減少需要呼叫的不同程式或可執行檔案的數量以及需要重新格式化資料步驟的數量。

最後，QIIME 2是開源的，有經驗的研究人員可貢獻個人的程式碼，以擴大本軟體的工作範圍。任何工具都可以作為外掛新增到QIIME 2中，它可以為任何軟體、包或其他可安裝、可執行檔案提供介面。為自己的開發的方法編寫QIIME 2外掛，使得成千上萬的使用者立即訪問並使用它。

老司機上路前的幾點建議

Pro-tips for power users

以下是我們學到的一些技巧，這些經驗將有助於您將工作流程轉變為QIIME 2：

提示1: QIIME 2物件只是zip檔案。如果您想檢視.qza物件中的檔案，可以使用qiime匯出工具來提取資料檔案（它基本上只是用於解壓縮的工具）。或者，您也可以直接解壓縮物件（unzip -k file.qza）並檢視資料/資料夾中的檔案。

提示2：QIIME 2命令列介面工具執行速度較慢，因為它每次呼叫物件時都必須解壓縮和重新壓縮物件中包含的資料。如果需要更多互動地處理資料，您可能希望使用Python API——它更快，因為物件可以簡單地儲存在記憶體中。您可以瞭解更多關於不同QIIME 2介面的資訊。

資料處理步驟

Data processing steps

本教程中將介紹的處理步驟包括：

將原始序列（FASTQ）資料匯入QIIME 2
資料樣本拆分（即，將每個序列對映到它來源的樣本），去除序列中非生物部分(即引物)
執行質量控制和：
1. 使用有DADA2或deblur的去噪序列，和/或
2. 使用VSEARCH或dbOTU進行質量篩選、長度剪下和聚類
物種分類
分析資料並獲得生物學意義！

教程綜述和可用外掛列表可以為其他可能的處理和分析步驟提供思路。

資料匯入

Importing data into QIIME 2

相關外掛：qiime tools import

如果使用QIIME 2處理資料，則首先需要將該資料轉換成QIIME 2能夠理解的格式。QIIME 2中當前可用的各種匯入方法在QIIME 2匯入教程中重點介紹。

這個步驟可能是QIIME 2分析流程中最令人困惑的部分，因為有許多匯入和格式型別可供選擇。要檢視可用匯入/格式型別的完整列表，請使用：qiime tools import --show-importable-formats(見附錄1)和qiime tools import --show-importable-types(見附錄2)

如果匯入FASTQ資料，則很可能需要生成一個清單檔案，該檔案只是一個文字檔案，將每個FASTQ檔案對映到其樣本ID和說明（如果可用）
。
如果你的資料是兩種非常特殊的格式（EMP或Casava）之一的序列資料，則可以直接匯入包含序列檔案的資料夾，方法為--type EMPSingleEndSequences或--type'SampleData[PairedEndSequencesWith.]（或其相應的雙端型別）。否則，如果您沒有這兩種非常特定的格式之一，則需要製作清單檔案以給出關於匯入什麼和如何匯入檔案的匯入指令。

如果希望直接匯入FASTA檔案或特徵表，也可以使用不同--type的標誌或qiime tools import。匯入教程詳細介紹了所有這些選項。

樣本拆分

Demultiplexing sequences

相關外掛

q2-demux
cutadapt

如果在同一個檔案中包含了多個樣本，則需要對序列進樣本拆分。

如果您的條形碼（barcodes）已經從序列中移除，並且位於單獨的檔案中，則可以使用q2-demux對這些條形碼進行樣本拆分。

如果你的條形碼還在序列中，你可以使用cutadapt外掛的函式。cutadap demux-single方法在序列的開始（或5’末端）查詢具有特異容錯性的條形碼序列，刪除它們並返回由每個樣本單獨的序列資料。QIIME 2論壇上有關於cutadapt中各種功能的教程，包括樣本拆分。通過閱讀這些文件，你可以瞭解更多關於cutadapt如何工作的。

注意：目前q2-demux和q2-cutadapt不支援雙端條碼的樣品拆分，而且只能在正向序列中查詢條碼並進行拆分。因此，目前這種型別的樣本拆分需要使用其他工具（例如bcl2fastq）在QIIME 2之外完成。

雙端合併

Merging reads

相關外掛：q2-vsearch

是否需要合併序列取決於你計劃如何將序列聚類或去噪為擴增序列變體（ASV）或操作分類單元（OTU）。如果接下來打算使用deblur或OTU聚類方法，現在就合併序列。如果計劃使用dada2對序列進行去噪，則不要合併——dada2會在對每個序列進行去噪之後自動執行序列合併。

如果需要合併序列，可以使用QIIME 2 q2-vsearch外掛的join-pairs方法。

去除非生物序列

Removing non-biological sequences

相關外掛

q2-cutadapt
dada2

如果您的資料包含任何非生物序列（例如，引物、測序接頭、PCR間隔區等），則應該刪除這些序列。

q2-cutadapt外掛具有從成對或單端資料中去除非生物序列的多種方法。

如果要使用DADA2對序列進行去噪，可以在呼叫去噪函式的同時刪除非生物序列。DADA2的所有去噪函式都具有某種--p-trim引數，您可以指定該引數來從序列的5’末端刪除鹼基。（Deblur沒有這個功能。）

相似序列分組

Grouping similar sequences

將相似序列分組主要有兩種方法：去噪和聚類。概述教程提供了對這些方法更深入的討論。

無論如何對序列進行分組，分組方法將輸出：

每個OTU和/或ASV的代表序列（QIIME 2資料格式FeatureData[Sequence]），以及
一個特徵表，它指示每個樣本中每個OTU/ASV的測序次數。(QIIME 2資料格式特徵表[頻率]FeatureTable[Frequency])

DADA2和deblur還將生成一個帶有關於過濾和去噪的相關資訊的統計摘要檔案。

去噪

Denoising

相關外掛：

DADA2
deblur

DADA2和deblur是目前QIIME 2中可用的兩種去噪方法。您可以在概述教程中瞭解更多關於這些方法的資訊。

DADA2和deblur都輸出精確的序列變體（exact sequence variants，ESV），據推測這些變體更能代表存在於資料中的真實生物序列。它們的建立者對於這些序列有不同的術語（DADA2稱它們為“擴增序列變體”（ASV），deblur稱它們為“subOTU”）。我們將在本教程中使用ASV術語來統一代表這兩種輸出。

準備去噪資料

去噪只需要很少的資料準備。DADA2和deblur都執行質量過濾、去噪和嵌合體去除，因此在執行它們之前不應該執行任何質量篩選。deblur開發人員建議在使用deblur之前使用預設設定進行初始質量篩選（如“人體不同部分微生物組”教程所示）。DADA2內建了基於Q值的過濾，因此在用DADA2進行去噪之前執行這個質量過濾步驟是不必要的。

兩種方法都具有將序列截斷為恆定長度（在降噪之前發生）的選項。在DADA2中，這是–p-trunc-len引數；在deblur中，它是–p-trim-length。截斷引數對於DADA2和deblur都是可選的（但是如果使用deblur，則需要指定–p-trim-length -1來禁用截斷）。比截斷長度短的讀被丟棄，而比截斷長度長的序列在指定位置被截斷。概覽教程中有更多關於決定截斷到什麼長度的討論。

DADA2去噪

DADA2外掛有多種方法進行序列去噪：

去噪雙端序列，要求未合併的雙端序列（即包括正向和反向序列）。
去噪單端序列列，需要單端或未合併的雙端資料。如果向其提供未合併的成對端資料，則它將只使用正向序列（而對反向序列不做任何操作）。
去噪-焦磷酸測序，可接受 ion torrent 測序儀的資料。

注意，對於非常大的資料集，DADA2可能非常慢。可以通過增加--p-n-threads引數使用多執行緒縮短計算時間(前提是你的系統有足夠多的執行緒)。

deblur去噪

deblur 外掛具有兩種序列去噪的方法：

deblur-16S 對16S序列進行去噪。
deblur-other 去噪其他型別的序列。

如果使用deblur-16S，deblur執行初始的正向過濾步驟，其中它丟棄與85% GreenGenes 資料庫中OTU的序列小於60%相似性的任何序列。如果不想執行此步驟，請使用deblur-other方法。

deblur目前只能對單端序列進行去噪。如果提供末合併的雙端序列為輸入，將對反向序列不作任何操作。請注意，deblur接受合併的序列，並將它們視為單端序列，因此如果使用deblur進行去噪，需要先合併讀取。

OTU聚類

OTU Clustering

在本教程中，我們將涉及QIIME 2的無參(de novo)和有參(closed reference)兩類聚類方法。QIIME OTU聚類教程部分有更多的細節。

對序列進行聚類，你需要確保：

雙端序列已經合併
非生物序列已經去除(如引物)
序列擷取為相同的長度
低質量序列已經去除

我們討論了合併雙端序列，和刪除非生物序列（詳見相關章節）。

一旦你的資料已經符合以上要求，你需要在聚類前先將序列進行去冗餘。

長度修整Length trimming

如果由於某種原因，原始序列沒有完全相同的長度，則需要在進行OTU聚類之前將它們修剪到相同的長度。目前還沒有一個QIIME 2函式在不做其他任何事情的情況下可將序列調整至相同長度，你可以使用cutadapt外掛中的函式來完成此事。（這是因為QIIME 2工作流建議首先序列去噪（這裡麵包括了長度修剪步驟），然後可選地通過聚類演算法獲得ASV。）

質量過濾Quality filtering

相關外掛：quality-filter

您可以使用質量篩選器外掛執行不同型別的質量篩選。q-score方法可用於單端或雙端序列（即，SampleData[PairedEndSequencesWithQuality | SequencesWithQuality]），而q-score-joined方法用於合併後的雙端序列（即合併後的SampleData[JoinedSequencesWithQuality]）。每個方法的選項描述了不同型別的質量篩選。

序列去冗餘Dereplicating sequences

相關外掛：q2-vsearch

不管你使用哪種型別的聚類，您首先需要去除序列的重複。q2-vsearch外掛的dereplicate-sequences方法可完成此步操作。

無參聚類de novo clustering

相關外掛：

q2-vsearch
q2-dbotu

序列可以僅基於它們的遺傳相似性(即VSEARCH)或基於它們的遺傳相似性和豐度分佈的組合(即基於分佈的聚類)的從頭/無參(de novo)聚類。

基於相似度的聚類。q2-vsearch外掛聚類方法為cluster-features-de-novo。可以使用--p-perc-identity引數更改遺傳相似性閾值。該外掛包裝自--cluster_size函式。
基於分佈的聚類結合了序列之間的相似性和它們的丰度分佈，以識別具有生態意義的種群。您可以在外掛文件、原始文獻和更新文獻中進一步瞭解此方法。q2-dbotu外掛中的call-otus函式對輸入資料執行基於丰度分佈的聚類。

這兩個函式都以q2-vsearch去冗餘的輸出作為輸入，這些去冗餘的序列具有QIIME 2“FeatureData[Sequence]”資料型別，以及結果的計數表(counts table，整數頻率彙總表)的QIIME 2“FeatureTable[Frequency]”資料型別。

有參聚類closed reference clustering

相關外掛：q2-vsearch

有參聚類將與資料庫中參考序列以某種相似性的序列分組在一起。

VSEARCH可以用cluster-features-closed-reference方法進行有參聚類。此方法封裝了VSEARCH中的--usearch_global函式。可以使用--i-reference-sequences引數決定要針對哪個參考資料庫進行聚類。這個引數的輸入檔案應該是一個包含fasta檔案的.qza檔案，fasta檔案具有用作參考資料庫的序列，並採用QIIME 2資料型別FeatureData[Sequence]。大多數人對16S rRNA基因序列使用GreenGenes或SILVA，但是其他人使用自己手工校正的資料庫或使用其他標準參考（例如，ITS資料的UNITE）。您可以從QIIME 2資料資源頁面上的連結下載這些參考資料庫。您將需要解壓縮(unzip/untar)並將它們作為FeatureData[Sequence]物件匯入，因為它們是作為原始資料檔案提供的。

物種分類

Assigning taxonomy

相關外掛：feature-classifier

將物種註釋分配給ASV或OTU代表序列的方法，包含在物種分類教程中。所有物種分配方法都在feature-classifier外掛中。

有兩類物種分類方法，每類都有多個可用的方法。

第一類是直接將序列與參考資料庫比對：

classify-consensus-blast：採用BLAST+的區域性比對
classify-consensus-vsearch：VSEARCH全域性比對

兩者都使用物種分配的一致方法，您可以在概述中瞭解更多，並調整maxaccepts、perc-identity和min-consensus引數。

第二種方法使用機器學習分類器為序列分配可能的物種註釋，並且可以通過classify-sklearn命令實現。

此方法需要一個預先訓練好的模型來對序列進行分類：您可以從資料資源頁面下載一個預先訓練好的物種註釋分類器，或者自己訓練一個（按照特性分類器教程中概述的步驟）。（您還可以瞭解更多關於外掛相關論文中實現特定模型的資訊。）

分析特徵表獲得新發現

Analyze feature table and gain insight

相關外掛：太多了！

此時，您應該準備好分析特性表來回答您的科學問題！QIIME 2提供了多個內建函式來分析此類資料，並且您還可以匯出它，並使用您擅長的程式語言或軟體包進行下游分析。

使用QIIME 2可以做的一些常用分析包括：

資料檢視：QIIME 2有一個不錯的物種組成條形圖視覺化工具，使視覺化地探索資料變得容易。您還可以使用emperor外掛（在計算樣本之間的β距離矩陣之後）在PCoA繪圖上視覺化資料。
構建一個系統發育樹：QIIME 2有一個具有不同樹構建方法的系統發育樹的外掛。
計算樣本的α多樣性：多樣性外掛通過alpha、 alpha-phylogenetic方法提供了許多α多樣性度量方法。
計算樣本之間的β多樣性：多樣性外掛在beta、beta-phylogenetic和beta-phylogenetic-alt方法中也有多種度量方法。注意，diversity core-metrics 和diversity core-metrics-phylogenetic是α和β多樣性分析的方便包裝。這些內容在概述教程中進行了描述。
通過差異丰度或分佈檢驗來統計樣品之間的差異：PERMANOVA、ANOSIM、ANCOM和Gneiss是QIIME 2中可用的一些統計方法。PERMANOVA和ANOSIM可以用多樣性外掛中的beta-group-significance方法完成。ANCOM在composition外掛中可用。Gneiss 外掛中提供了gneiss功能，並有相關的教程“Gneiss 差異丰度分析”。
構建機器學習分類器和迴歸器以進行預測：q2-sample-classifier外掛有幾個用於構建分類器和迴歸器的功能，並且相關的“使用q2-sample-classifier預測樣本元資料值”教程提供了更多細節。

資料匯出

Export the data

相關外掛：qiime tools export

如果您是一位經驗豐富的微生物科學家，並且不想使用QIIME 2進行下游分析，那麼可以使用匯出工具從物件中提取特徵表和序列。雖然export功能只輸出資料，但是提取工具還允許您提取其他元資料，如引文、資料分析過程等資訊。

請注意，通常的檔案在輸出目錄名為feature-table.txt，因此您可能希望立即將檔案重新命名為更多資訊（或者確保它保留在原始目錄中）！

您還可以使用方便的R包qiime2R將QIIME 2物件直接匯入R。

新的外掛

New plugins

可以多看看QIIME 2不斷增長的外掛列表，以找到其他適合應用於你資料的方法。

請記住，您還可以製作自己的QIIME 2外掛，以向QIIME 2新增功能，並與同行共享！

附錄1. 可匯入的重要資料格式

qiime tools import --show-importable-formats

AlignedDNAFASTAFormat
AlignedDNASequencesDirectoryFormat
AlphaDiversityDirectoryFormat
AlphaDiversityFormat
BIOMV100DirFmt
BIOMV100Format
BIOMV210DirFmt
BIOMV210Format
BooleanSeriesDirectoryFormat
BooleanSeriesFormat
CasavaOneEightLanelessPerSampleDirFmt
CasavaOneEightSingleLanePerSampleDirFmt
DADA2StatsDirFmt
DADA2StatsFormat
DNAFASTAFormat
DNASequencesDirectoryFormat
DeblurStatsDirFmt
DeblurStatsFmt
DistanceMatrixDirectoryFormat
EMPPairedEndCasavaDirFmt
EMPPairedEndDirFmt
EMPSingleEndCasavaDirFmt
EMPSingleEndDirFmt
FastqGzFormat
FirstDifferencesDirectoryFormat
FirstDifferencesFormat
HeaderlessTSVTaxonomyDirectoryFormat
HeaderlessTSVTaxonomyFormat
ImportanceDirectoryFormat
ImportanceFormat
LSMatFormat
MultiplexedPairedEndBarcodeInSequenceDirFmt
MultiplexedSingleEndBarcodeInSequenceDirFmt
NewickDirectoryFormat
NewickFormat
OrdinationDirectoryFormat
OrdinationFormat
PairedDNASequencesDirectoryFormat
PairedEndFastqManifestPhred33
PairedEndFastqManifestPhred64
PlacementsDirFmt
PlacementsFormat
PredictionsDirectoryFormat
PredictionsFormat
QIIME1DemuxDirFmt
QIIME1DemuxFormat
QualityFilterStatsDirFmt
QualityFilterStatsFmt
SampleEstimatorDirFmt
SingleEndFastqManifestPhred33
SingleEndFastqManifestPhred64
SingleLanePerSamplePairedEndFastqDirFmt
SingleLanePerSampleSingleEndFastqDirFmt
TSVTaxonomyDirectoryFormat
TSVTaxonomyFormat
TaxonomicClassiferTemporaryPickleDirFmt
UchimeStatsDirFmt
UchimeStatsFmt

附錄2. 可匯入的重要資料型別

qiime tools import --show-importable-types

DeblurStats
DistanceMatrix
EMPPairedEndSequences
EMPSingleEndSequences
FeatureData[AlignedSequence]
FeatureData[Importance]
FeatureData[PairedEndSequence]
FeatureData[Sequence]
FeatureData[Taxonomy]
FeatureTable[Balance]
FeatureTable[Composition]
FeatureTable[Frequency]
FeatureTable[PercentileNormalized]
FeatureTable[PresenceAbsence]
FeatureTable[RelativeFrequency]
Hierarchy
MultiplexedPairedEndBarcodeInSequence
MultiplexedSingleEndBarcodeInSequence
PCoAResults
Phylogeny[Rooted]
Phylogeny[Unrooted]
Placements
QualityFilterStats
RawSequences
SampleData[AlphaDiversity]
SampleData[BooleanSeries]
SampleData[ClassifierPredictions]
SampleData[DADA2Stats]
SampleData[FirstDifferences]
SampleData[JoinedSequencesWithQuality]
SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]
SampleData[RegressorPredictions]
SampleData[SequencesWithQuality]
SampleData[Sequences]
SampleEstimator[Classifier]
SampleEstimator[Regressor]
TaxonomicClassifier
UchimeStats

譯者簡介

劉永鑫，博士。2008年畢業於東北農大微生物學專業。2014年中科院遺傳發育所獲生物資訊學博士學位，2016年博士後出站留所工作，任巨集基因組學實驗室工程師，目前主要研究方向為巨集基因組學、資料分析與可重複計算和植物微生物組、QIIME 2專案參與人。發於論文12篇，SCI收錄9篇。2017年7月創辦“巨集基因組”公眾號，目前分享巨集基因組、擴增子原創文章300+篇，代表博文有《擴增子圖表解讀、分析流程和統計繪圖三部曲》，關注人數3萬+，累計閱讀400萬+。

Reference

https://qiime2.org/
Bolyen E, Rideout JR, Dillon MR, Bokulich NA, Abnet C, Al-Ghalith GA, Alexander H, Alm EJ, Arumugam M, Asnicar F, Bai Y, Bisanz JE, Bittinger K, Brejnrod A, Brislawn CJ, Brown CT, Callahan BJ, Caraballo-Rodríguez AM, Chase J, Cope E, Da Silva R, Dorrestein PC, Douglas GM, Durall DM, Duvallet C, Edwardson CF, Ernst M, Estaki M, Fouquier J, Gauglitz JM, Gibson DL, Gonzalez A, Gorlick K, Guo J, Hillmann B, Holmes S, Holste H, Huttenhower C, Huttley G, Janssen S, Jarmusch AK, Jiang L, Kaehler B, Kang KB, Keefe CR, Keim P, Kelley ST, Knights D, Koester I, Kosciolek T, Kreps J, Langille MG, Lee J, Ley R, Liu Y, Loftfield E, Lozupone C, Maher M, Marotz C, Martin BD, McDonald D, McIver LJ, Melnik AV, Metcalf JL, Morgan SC, Morton J, Naimey AT, Navas-Molina JA, Nothias LF, Orchanian SB, Pearson T, Peoples SL, Petras D, Preuss ML, Pruesse E, Rasmussen LB, Rivers A, Robeson, II MS, Rosenthal P, Segata N, Shaffer M, Shiffer A, Sinha R, Song SJ, Spear JR, Swafford AD, Thompson LR, Torres PJ, Trinh P, Tripathi A, Turnbaugh PJ, Ul-Hasan S, van der Hooft JJ, Vargas F, Vázquez-Baeza Y, Vogtmann E, von Hippel M, Walters W, Wan Y, Wang M, Warren J, Weber KC, Williamson CH, Willis AD, Xu ZZ, Zaneveld JR, Zhang Y, Zhu Q, Knight R, Caporaso JG. 2018. QIIME 2: Reproducible, interactive, scalable, and extensible microbiome data science. PeerJ Preprints 6:e27295v2 https://doi.org/10.7287/peerj.preprints.27295v2

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學習擴增子、巨集基因組科研思路和分析實戰，關注“巨集基因組”

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