題目：基於腸道菌群組成的“腸型”如何定義？

認識腸道菌群領域的29位大佬，從熟悉他們的名字和單位開始。

作者：Paul I. Costea 1, Falk Hildebrand 1,2,3, Arumugam Manimozhiyan 4, Fredrik Bäckhed 5,6, Martin J. Blaser 7, Frederic D. Bushman 8, Willem M. de Vos 9,10, S. Dusko Ehrlich 11,12, Claire M. Fraser 13, Masahira Hattori 14, Curtis Huttenhower 15, Ian B. Jeffery 16, Dan Knights 17,18, James D. Lewis 19, Ruth E. Ley 20, Howard Ochman 21, Paul W. O’Toole 16, Christopher Quince 22,
David A. Relman 23,24,25, Fergus Shanahan 16, Shinichi Sunagawa 1,26, 王俊 5,27,28,29,30,
George M. Weinstock 31, Gary D. Wu 32, Georg Zeller 1, 趙立平 33, Jeroen Raes 2,3,34*,
Rob Knight 35,36,37,38* and Peer Bork 1,39,40*

1. 德國，海德堡，歐洲分子生物學實驗室(EMBL)
2. 比利時，VIB微生物中心
3. 比利時，布魯塞爾大學，微生物實驗室
4. 丹麥，哥本哈根大學，衛生和醫學科學系，諾和諾德基金會基礎代謝研究中心
5. 瑞典，哥德堡大學，薩爾格學院，醫學研究所，分子與臨床醫學系，瓦倫堡實驗室
6. 丹麥，哥本哈根大學，衛生科學系，受體與腸內分泌代謝部，諾和諾德基金會基礎代謝研究中心
7. 美國，紐約大學，朗格尼醫學中心
8. 美國，費城，賓夕法尼亞大學醫學院，微生物系
9. 芬蘭，赫爾辛基大學，細菌與免疫系
10. 荷蘭，瓦赫寧根大學，微生物實驗室
11. 法國，朱昂薩斯，國家農業研究院，MetaGenoPolis (MGP)計劃
12. 英國，倫敦，Guy醫院，牙科中心辦公室，宿主與微生物組互作中心；倫敦國王學院
13. 美國，巴爾的摩，馬里蘭大學醫學院，基因組研究所
14. 日本，東京，早稲田大學，高等科學與工程研究生院
15. 美國，波士頓，哈佛公共衛生學院，生物統計系
16. 愛爾蘭，科克郡，科克大學，APC微生物組研究所
17. 美國，明尼蘇達，聖保羅，明尼蘇達大學，生物技術研究所
18. 美國，明尼阿波里斯市，明尼蘇達大學，電腦科學與工程系
19. 美國，費城，賓夕法尼亞大學醫學院，臨床流行病與生物統計中心
20. 德國，圖賓根，MPI微生物組科學部
21. 美國，德州，奧斯丁，德州大學綜合生物學系
22. 英國，考文垂，華威大學，華威醫學院
23. 美國，加州，斯坦福大學，微生物與免疫系
24. 美國，加州，斯坦福大學，醫學部
25. 瑞士，蘇黎世聯邦理工學院，微生物所，生物部
26. 丹麥，哥本哈根大學，生物系
27. 沙特，吉達，阿卜杜勒阿齊茲國王大學，遺傳異常研究中心
28. 中國，澳門，凼仔島，澳門科技大學中醫藥學院
29. 香港，薄扶林，港大，醫學、醫藥生物技術國家重點實驗室
30. 美國，法明頓，傑克遜基因組醫學實驗室
31. 美國，費城，賓夕法尼亞大學醫學院，腸胃病學系
32. 中國，上海交通大學，上海系統生物醫學中心，系統生物醫學教育部重點實驗室
33. 比利時，魯汶大學，微生物與免疫系
34. 美國，博爾德，科羅拉多大學，計算機科學系
35. 美國，博爾德，科羅拉多大學，生物前沿研究所
36. 美國，博爾德，科羅拉多大學，化學與生化系
37. 美國，博爾德，科羅拉多大學，霍華德·休斯醫學研究所
38. 德國，柏林，Max DelbrüCK分子醫學中心
39. 德國，海德堡，分子醫學夥伴單位

來自EMBL的Paul I. Costea和Falk Hildebrand為共同第一作者。科羅拉多大學的Rob Knight和EMBL的Peer Bork為共同通訊作者。

摘要

群體分型(分層/層化，stratification)是一種有助於更好的理解人類身心健康等複雜生物學問題的有效方法。將這種方法應用於腸道微生物中，可以將不同的群落組成定義為腸型，對科學研究產生了積極的影響，但也引發了巨大的爭議。我們基於原始工作發表以來積累的大量資料進行重新分析，重新審視腸型這一概念，討論區分微生物組結構的不同方法，並將這些概念應用於功能、生態和醫學領域內。由於腸型在描述腸道微生物群落結構時非常有效，且可能用於指導臨床實踐，因此我們呼籲合理的使用這一概念並希望協調出現的不同觀點。

正文

人體內定殖著數萬億的有益於身心健康的微生物，通常不同的微生物群落定殖在不同的人體部位 (圖1)。研究表明不同人同一部位的微生物群落組成差異很大，同一個人的不同部位的微生物群落組成也顯著不同 (圖1)。

圖1. 健康人身體不同位置微生物組在屬水平明顯分開

人體內最複雜的定殖環境當屬腸道，據估計大約有150克的微生物定殖於此，包括各種各樣的細菌和古菌，其中以厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為主要類群。個體間微生物群落的差異已經被廣泛證明，例如美國的人類微生物組計劃(HMP)，歐洲的腸道巨集基因組計劃(MetaHIT)和眾多其他的腸道菌群研究，都證明此現象的存在。此外，研究還表明腸道微生物群落變化表現出不同的演替階段，可分為：嬰幼兒快速變化期，成人穩定期和老年退化期。
目前，在大人群和跨地理研究中，還很難簡單的描述如此複雜的生物現象，部分原因是有些類群在不同個體間表現為單峰(正態分佈)，而另外一些類群又表現出雙峰或者更復雜的分佈模式(圖2a)。
考慮到腸道系統的重要性和複雜性，確定微生物群落組成的結構模式及其背後的組裝機制是非常必要的，這些能夠幫助我們更好的瞭解人體的健康和疾病狀態。基於群落組成結構的分類方法將加強基於微生物的疾病診斷、治療或預防，並在營養、微生物和藥物干預方面對個性化治療產生影響。這種基於微生物組成的模式可以被用來對人群進行分類，類似於癌症研究中常用的分子亞型分類，例如，在臨床上，基於基因表達的模式與乳腺癌子類是相關的。然而，我們也應注意到，在其他情況下，如結直腸癌，這種分類方式的有效性仍不清楚，值得注意的是分子水平的分型並不是在所有情況下都適用。

圖2. 人類腸道微生物群落組成的分型。
a, 人類腸道中普遍微生物屬的丰度分佈非常複雜。基於278個MetaHIT樣品中腸型主要指示物種多度資料分析得到的beta多樣性的理論分佈模式（左）和實際分佈模式（中）和腸型空間分佈（右）。在3個大資料集中，當擬桿菌（Bacteroides）丰度分佈接近於對數正態分佈時，普氏菌屬（Prevotella）則表現為雙峰分佈，暗示兩種分佈的混合型可以更好的解釋觀察值，這種現象可能來自於兩種完全不同的生態過程，一個對應群落內優勢物種的狀態，另一個對應相對稀有物種的狀態。
b, 有關腸型研究的地理分佈（附表1）；報道的腸型數量在圖中用顏色標示，點代表研究中樣品來自於哪個國家。連線代表樣品屬於同一個研究專案。大部分研究來自西方國家，可能對結果造成偏差，從而忽略其他人群中的腸道菌群的變異。
c, 基於多元正態分佈模擬微生物組成的示意圖，存在三個高密度主峰，每一種代表一種腸型，峰圖可以更清晰的展示腸型的概念。此圖可以通過修改不同的引數來對圖中空間分割，從而在覆蓋不同人群樣品範圍內（由交叉平面表示）產生不同的叢集數量（2個或者3個），
d, 同一群體基於不同分類方法定義的腸型。最上面的圖層將空間分割為3個離散的空間。

穩定的微生物群落變異模式已經在成人腸道研究中被證明，例如：主要類群如擬桿菌(Bacteroides)和普氏菌屬(Prevotella)的比例在成人腸道內是穩定的(圖2a和附圖1)。當微生物群落組成的變異被劃分成叢集/組(cluster)後，它們可以被稱作為腸型(enterotypes)，並且可以作為一種非常有效的區分人體腸道微生物的方法。後來，此研究方法被應用於其他生態系統如陰道和身體其他部位的微生物群落的分類。然而，由於腸道微生物聚類方法的差異，自腸型的概念提出以來，關於腸型的數量和存在其他不同型別的討論從未間斷。

在本文中，我們採用來自三個大陸的巨集基因組大資料（包括美國的人類微生物組計劃(HMP)，歐洲的腸道巨集基因組計劃(MetaHIT)和中國二型糖尿病研究資料）來評估腸道微生物群落組成的變化並驗證不同的假說。我們通過精細的元分析，提出了一種改進的腸型概念，目的是協調出現的不同觀點。研究結果展示了聚類和其他分層分析方法的優點和缺點。我們發現腸道微生物群落是結構化的，雖然在統計學上沒有強有力的支援，但聚類的方法還是可以為微生物組資料提供有效的解釋。另外，由於群落水平的分層分析只解釋了微生物群落變化的某些方面，因此，這種分析方法並不能替代其他分析方法對群落變異的解釋。

腸道微生物群落組成模式的穩定性

通過研究上面提到的3個大資料集，我們發現在腸道菌群中，屬水平的群落組成可以將樣品很好的分組(附圖2)，這一結果與腸型研究的原始文獻的結果一致。也就是說，某些相對豐富的微生物出現頻率要高於其他物種。這些現象都可以通過計算樣本之間的距離、研究產生的分組，以及通過直接觀察一些腸道微生物類群丰度的複雜分佈來驗證(圖2)。這種微生物群落結構對特定微生物的偏好是適度的，導致在偏好某種微生物的叢集周圍形成更高的樣品密度，但是我們也可以發現有許多樣品處於不同的分組之間。這種現象的出現導致我們很難用精確的數學的方法來描述這些偏好某種微生物的微生物群落，也很難確定這類高度密叢集的數量，這就促使人們採用另一種方式來描述這部分割槽域，即梯度結構(gradients，連續不可分型)。然而，我們要清楚在群落變化研究中什麼是最重要的？描述這些區域性最優的群落組成，是為了更好的理解生態限制和群落特性對群落結構的影響機制。

2011年，採用三種測序技術(Illumina、454和Sanger)，對來自三個國家(丹麥、西班牙和美國)的人類糞便樣本中的16S rRNA基因進行測序分析，得出腸道微生物存在三種腸型的結果。腸型被描述為“在群落組成的多維尺空間中樣品密集的叢集”，並且其不會受年齡、性別、文化背景和地理位置的影響。對每一種腸型的特性研究，發現共存的微生物網路中心存在一種指示/驅動類群，即這一類微生物與給定的腸型最相關。例如：腸型1，又可以表示為ET B，Bacteroides(擬桿菌)是其最好的指示類群；腸型2，又可以表示為ET P，是由Prevotella(普氏菌)驅動的，它的丰度通常與擬桿菌的丰度成反比；腸型3，又可以表示為ET F，是通過Firmicutes(厚壁菌)佔比高低來區分的，其中最主要的類群為Ruminococcus(瘤胃球菌)。 以上所有分析都是基於屬水平分類進行的，因為屬水平可以更好的反映生態位變化。儘管有一些屬表現出功能異質性，如鏈球菌(streptococci)，它既包含常見的共生菌和致死性病原體，又包含可以用於食物發酵的類群，但通常屬水平的分析還是比較可靠的。這種方法雖然可以促進個體間功能差異在臨床中的應用，但是我們也不應該忽略群落在物種水平和菌株水平的變異。

大部分的研究都證實了三種腸型的存在，最初的定義也已經明確了腸型是非離散的，聚類只是一種為了對樣本分組以降低複雜性來定義腸型的方法 (見圖3a叢集和屬丰度的比較)。儘管這一人為的定義存在侷限性，由此產生的群落聚類只能部分地反映群落間距離的複雜結構，但腸型的概念已經證明對分析微生物組資料非常有幫助。

圖3. 人類糞便樣品微生物組存在結構亞型。
採用Jensen–Shannon距離排序278個MetaHIT樣品。
a, 主要差異屬的對數轉換的相對丰度。在相鄰的浮點軸上，展示了不同型別間投影丰度變化。圖中的雙峰丰度譜(虛線)和漸變丰度(實線)分別支援了梯度漸變(連續不可分)模型和非連續分組模型。
b, 三種腸型的COG排序投影也表明腸型間功能存在差異。
c, 巨集基因組水平OTU的Shannon多樣性指數和基因丰度（少於480000個基因定義為為低基因數，其它為高基因數）在不同腸型間顯著不同，大多數為梯度漸變型別。
d, 飲食和疾病與普氏菌屬（Prevotella）、厚壁菌門（Firmicutes）或擬桿菌門（Bacteroides）豐富的腸道菌群的關係（附表5）。為方便區分，在a, b, d中3種腸型均採用顏色區分。

隨後對新資料集的研究也在不同程度上證明了腸型的存在，包括對腸型數量的驗證和提供的統計學證據，當然也存在一些沒有發現此類結構的研究(圖2和附表1)。例如，一項關於美國人飲食的大資料分析結果支援2種腸型的結論，一種型別包含與ET P類似的優勢類群，另一種為ET B和ET F型別的混合型。 HMP的16S資料，四個巨集基因組資料和一個佛蘭德人群資料的研究結果與腸型原始文獻的結果類似，證明存在三種腸型。一項關於委內瑞拉、馬拉維農村地區和美國大都會地區的人群研究則強調了普氏菌(Prevotella)和擬桿菌(Bacteroides)為驅動類群，另外還發現嬰兒具有與成人完全不同的腸道菌群，主要含有雙歧桿菌(Bifidobacteria)和變形菌(Proteobacteria)。研究發現，人類在3歲至9歲之間腸道菌群的腸型結構逐漸建立(發現類腸型結構)，表明基於有限樣本時推斷全世界不同年齡段人群腸道菌群的結構需要十分小心。

除聚類方法以外，Holmes等提出了另外一種區分菌群結構的方法。這種方法關注屬水平的真實丰度而不是樣品間距離，為每一個可能的結構生成一個模型，並確定每個模型如何解釋觀察到的資料。採用這種多項式混合模型(Dirichlet multinomial mixture models，DMMs)對腸型原始文獻中的資料進行分析，證明很可能存在四種腸型(此處也籠統的稱其為“叢集”)。其中的兩個叢集類似於ET B和ET P，而第三個叢集中瘤胃球菌(Ruminococcus)和厚壁菌(Firmicutes)內相關屬為優勢類群，但是這些類群在腸道菌群中通常含量很低。最後一個叢集中則含有大量未鑑定的類群。DMMs還被用於分析瑞典健康人群的腸道菌群資料，結果確定了三個叢集，同樣有兩個叢集的群落組成類似於ET B和ET P，在另外一個叢集中優勢類群為一個未鑑定類群。另一項研究採用此方法對HMP中的16S rRNA基因資料進行分析，發現腸道微生物組有四個相似的模型。應用DMMs 分析MetaHIT巨集基因組資料集時，可以確定四個叢集，其中兩個叢集與ET B和ET P重合，而另兩個叢集為一個更復雜的混合群(圖2，附圖3)。然而DMMs屬於更嚴格的統計方法，未來還需要進一步確認生成模型的分佈假設是否適合微生物組資料。

儘管對腸型分類起主要貢獻的三種腸道微生物——普氏菌(Prevotella)、擬桿菌(Bacteroides)和瘤胃球菌(Ruminococcaceae)是腸道菌群核心物種，但是有研究已經證明其相對丰度在個體間存在最大的變異。另外，基於總體資料的網路方法也確定這三種腸道微生物為三個共存網路叢集的核心物種，並證明它們的丰度是相互負相關的。同樣，一項關於腸道菌群內35個主要類群的的qPCR資料也展示了這樣的負相關關係。此外，在阿米什成人腸道菌群中也存在3個不同的網路，這些網路中的優勢屬與原始研究中腸型的驅動類群高度重合。類似地，在一個由愛爾蘭成年人和老年人組成的資料集裡，報道了6個共丰度類群(co-abundance groups, CAGs)，且證明健康人群都具有和原始腸型相對應的網路結構。因此，有別於聚類和建模方法，細菌共存網路是另一種解釋這些聚叢集落主要特徵的方法。理論研究已經證明在具有不同相互作用強度的群落中容易產生類似於腸型的結構。

儘管動物的腸道菌群與人類不同，但是最近在幾項動物實驗中也報告了類似於腸型的結構。在控制實驗中，小鼠的腸道微生物群落中，聚類方法可以將其分成明顯的叢集，然而在野生動物(老鼠、靈長類和野豬)中，這種叢集趨勢則比較微弱。這表明，當沒有外部因素影響微生物群落時，更容易出現聚集的群落狀態。因此，腸型並不是人體腸道菌群特有的，動物中同樣存在這些現象，這一結果使人們認為，腸型在泛人類分裂之前就已經存在了。腸道菌群在進化過程中主要受競爭影響，並且受到來自宿主的壓力限制，因此，腸型可以代表這一共生群落的最適狀態，以達到群體效應的區域性最優，併兼容宿主所施加的壓力限制。

定義微生物群落型別的挑戰

鑑於從生態學到哲學的各個學科都在討論微生物群落可能存在的狀態，評估叢集在腸道菌群研究中的作用是不容忽視的。考慮到腸型聚類的本質特性，以及對分類級別、距離指標、聚類演算法和叢集優化得分等方面的多種選擇，在研究中產生不同數量的叢集是不可以避免的(附圖4和補充資訊)，即使在相同的資料集上出現不同的叢集數量也不足為奇。儘管一些人認為，有些資料集(引文8, 16, 23, 29, 42, 43)並不支援腸型的存在，但是當採用相同的方法將屬於人體不同部位的樣本(面板、糞便、陰道和口腔)區分開時，即使這一區分方法也沒有多少統計支援(附圖4)，這種區分方法卻被科學界廣泛接受。

不管聚類支援率還是建模假設(詳見補充資訊)，基於三大公共資料集的分析都可以得到來自文獻報道的結論(附表1)，證明腸道菌群具有相似的的區域性子結構，也就是3個叢集的群落結構中總是存在擬桿菌屬（Bacteroides）、普氏菌屬（Prevotella）和厚壁菌門（Firmicutes）主導的叢集，兩個叢集的群落結構中可以根據普氏菌屬（Prevotella）的優勢度來區分樣品。因此，腸道菌群的劃分在一定意義上是穩定的，因為相關的聚類可以重複，並可以協調許多研究和支援群落組成的存在。

在複雜的微生物組成背景下，不同環境中腸道群落顯然會表現出一定的生物學差異。儘管合理的定義腸型和確定其臨界點還有很大挑戰，但是腸型的概念可以幫助我們更好的理解這些差異。這與大型生物研究中的叢集概念是相似的，儘管到目前為止，區分不同型別的環境，也面臨著相似的問題。例如，撒哈拉以南非洲地區的稀樹、草原和森林生態系統可以作為對平均降雨量梯度變化或者穩定狀態的對照。

考慮到準確定義腸道群落結構的挑戰，如克服間歇效應，考慮干擾因子(附圖5)和解釋時間變異，腸型穩定狀態的確切數字是很難確定的。儘管如此，在許多研究(主要為西方)中，無論應用什麼方法，擬桿菌屬（Bacteroides）和普氏菌屬（Prevotella）都是個體間最主要的差異類群，並能夠解釋最主要的變異。不同腸型間的微生物組成和多樣性上都有很大的不同，在隨後的討論中，有關它們的功能、生態和疾病等方面的情況都將涉及。儘管三種腸型可能不是對資料的最佳解釋，但它是最常用的模型，並且為我們研究腸道菌群提供可直接使用的框架。

腸型在功能與生態中應用

腸型間的物種組成不同表明其在功能和生態學意義上也不同。基於三大資料集的分析結果也表明微生物群落組成的差異導致了顯著的功能變異(圖3b)。事實上，考慮基因型別時，**大多數KEGG(京都基因與基因組百科全書)直系同源(KO)和非監督同源組(non-supervised orthologous
groups，NOGs)在三種腸型間存在64%和77%的差異(假陽性率FDR < 0.1)。同樣在eggNOG功能分類中，25個分類中23個存在顯著差異(附圖6)。其它的模型選擇二種或四種腸道分型方法，仍然存在廣泛的功能差異(附表3)，尤其與碳代謝高度相關。** 例如，報導過ET P腸型或者普氏菌屬（Prevotella；無腸型的報導)的研究，通常來自非西方或者飲食富含纖維的人群樣本。這一關聯讓我們更容易理解菌群功能的差異，普氏菌屬（Prevotella）水解酶專門分解植物纖維，另外，有研究發現ET P群落可以導致脂肪和蛋白的分解發酵能力下降。相反的，ET B群落結構與富含動物蛋白和飽和脂肪酸飲食相關，並且具有擬桿菌(Bacteroides)特異的碳水化合物酶(CAZymes)(附表2)。此外，我們發現在ET B群落中碳水化合物代謝酶顯著富集(附表3)，與最近關於糖和蛋白水解的潛能增加的研究一致。一些腸型間的功能差異可歸因為某個指示屬，另一些只是結構變化被動導致的(總量不變，相對增長就會有相對減少)。

腸型間的功能差異支援了不同群體特徵的概念，如豐富度、多樣性和時間穩定性。從生態學的角度來看，這些特徵都是相關的，理論預測了諸如腸道之類的動態系統的高多樣性，其營養供應和型別隨著時間的變化而波動。最早在阿米什人中採用16S擴增子測序報導了三種腸型的物種丰度不同，ET B有最低的物種丰度，此結果在最近一個更大的群體研究中被驗證。我們使用三個大的資料集分析，發現ET B種物種丰度最低，而ET F中物種丰度最高(附圖7，8)。採用夏農指數同樣發現ET F中物種丰度最高，而ET B和ET P中物種多樣性均下降(附圖8)。此外，這種差異與糞便稠度和/或樣品轉運時間的差異密切相關，其中轉運較慢的ETs也顯示了蛋白水解對糖精蛋白和蛋白水解代謝產物的相對比升高。

在許多研究中，健康成人的腸道群落組成在很長一段時間內不會發生顯著變化，表明成人體內生態系統與腸型狀態普遍比較穩定。然而，也有例外，我們在分析HMP巨集基因組時間序列資料中，其中也包括超過6個月個人樣品，其中三種腸型穩定存在，但也有16%的樣品腸型存在變化。這也表明：對於一些個體，腸型是可變的，且不存在明顯的邊界(附圖9)。
這一結果可以用腸道菌群的可變動態模型來解析：
(1) 偏好性群落組成的存在(即腸型，附圖10A);
(2) 個體特異性吸引子(attractors)的存在主要是由於個體的腸道群落的時間自相關(附圖10B)。
證明這些模型需要有關微生物群落對不同干擾下反應的資訊，從而使我們能夠確定個體是否有能力保持/恢復到原來的組成狀態或腸型。不幸的是，目前我們只有非常有限的腸道菌群干擾資料，如抗生素、糞便移植和飲食干預，並且許多資料都被排除在腸型定義的框架之外，所以很難得出哪個穩定狀態的模型是正確的結論。
短期的抗生素治療對人類腸道菌群的影響太劇烈，可以導致整個群落的瓦解，不適合研究腸道菌群的恢復能力。事實上抗生素治療可產生嚴重的菌群破壞，導致病原的入侵(如艱難梭菌)，並導致無法恢復至最初的菌群狀態。

飲食干預對人類腸道菌群生態系統的影響更溫和，因此適合用於研究腸道菌群的可塑性。研究發現，飲食干預可以在4天內導致腸型的改變，但是10天后趨於穩定，表明腸道菌群存在一種恢復至原始狀態的能力。採用普氏菌與擬桿菌相對比例定義腸型的分類方法，這種穩定性在6個月的干預實驗中同樣被觀測到。這一結果表明，個人的微生物組因短期飲食干預受多大影響還有待進一步研究，但支援腸型恢復能力的假說。與之相比，長期的干預可能產生更深選的影響，長達一年的飲食干預導致擬桿菌門（Bacteroidetes）/厚壁菌門（Firmicutes）比例發生變化，從而導致腸型的改變。隨著時間的推移，腸型通常變得比較穩定。對於長期干預缺少後續的研究，更沒有對其恢復力的近似研究(無論是從整體的群落相似性還是腸型的分類)。然而，有研究也暗示不同腸型可能恢復能力也不同，例如，據估計ET F中總體細菌的生長率最低，可能導致平衡狀態恢復的延遲。

雖然目前還不能預測特定的擾動將如何改變微生物組，但不同的微生物組結構，包括那些被定義的腸型結構，可能會在未來作為分類治療和指導飲食的建議。腸道菌群的調節對疾病尤其重要，目前的挑戰在於如何將一個人改變了的微生物組轉變回發病之前的健康狀態(菌群恢復或菌群人工調控)。

腸型在臨床應用

按照腸型對腸道菌群結構分類具有潛在的臨床意義。首先，在診斷上有助於判別個體的疾病狀態。其次，可作人體特定狀態的風險或易感指標。再次，層化可作為預後恢復的生物標記物。第四，不同腸型可影響異質性物質代謝，從而產生不同的藥物代謝動力學、藥物代謝動態差異。因此，腸道分型可作為指導治療的選項，有助於理解不同的治療措施。

目前，已經有一些腸型(或者主要的驅動物種)與人類疾病表型相關的報導。例如，增加擬桿菌或ET B腸型本身通常具有低的微生物多樣性(附圖7/8)，這與非酒精性脂肪肝炎(NASH)、結腸癌、乳糜症、免疫衰老和長期低度感染相關。在MetaHIT資料中，ET B與ET F相比(FDR < 0.1)，淋巴細胞數量和C反應蛋白顯著增長，同時ET F樣品有低於平均水平的胰島素抗性水平(附圖4)。普氏菌屬（Prevotella）丰度的增長與長期抗生素使用、風溼性關節炎、二型糖尿病和HIV相關(HIV在男同中高風險，可能混淆報導的關聯)。最後，ET F具有高的微生物多樣性，且能夠降低宿主感染程度，且報導與動脈硬化風險相關。鑑於不同疾病表型的大量關聯，腸型並不能單獨作為疾病診斷指標，但可以指示某些方面的風險。目前，在特定狀態下，健康個體疾病風險與腸型的關係研究的還很少，而且尚不清楚腸道菌群分類是否對疾病發展的預後有幫助。例如，在具有克羅恩病雜合等位基因易患克羅恩病的個體中，容易出現ET P腸型；而在MetaHIT研究中，克羅恩病風險人群中中以ET B為主，表明炎症可以影響這兩種腸型相互轉換，從而增加患炎症性腸病的風險。

最後，某些疾病可能會有不同的病因，這可能與腸型相關。分層可以幫助我們發現這些潛在的訊號，從而消除個體間微生物群落巨大變異的部分，而這些個體間的差異可能與疾病本身無關。在小鼠研究的例子中，分層可以發現基因型與微生物組、籠子與微生物組的關聯。同樣地，將人類患者分層為八個微生物叢集，有助於識別與微生物組成相關的醫學引數，顯著提高艱難梭菌(C. difficile)相關腹瀉分類的準確性。雖然目前沒有長期觀測的資料，但對飲食和藥物的反應以及腸道生理和生活方式的影響，也可能因人體不同位置而有所不同。因此，分層代表了不同臨床相關領域的切入點。它可以在很大程度上獨立於梯度-或以叢集為中心的觀點，類似於身體質量指數，定義的閾值是對患者疾病風險的重要指南。

更合理腸型分類的準則

為了使腸型概念更有意義，標準化是必不可少的。除了上文提到的技術困難外，單個樣品的分類也受到同批次其它樣品的影響。這種方式定義的腸型在不同研究中很難比較。例如，在一次單獨的研究中，大部分的樣品為ET B和ET F，只有極少的ET P，最優的聚類可能只有兩個或一個組。儘管如此，這些少量的ET P還是可以基於其它的資料庫來鑑定。比較不同的研究資料是比較困難的，因為不同的DNA提取方法、樣本處理方法、測序技術、引物選擇、資料處理過程(如rRNA聚類OTUs、拷貝數校正、嵌合體檢測)等導致細菌丰度檢測產生偏差(bias)，從而影響腸型的分類。在標準化這些步驟時，需要非常嚴格的標準，也許需要與人工重組微生物群落 結合在一起，並擴充套件到腸道中發現了的大量微生物系統基因譜，從而使標準樣品和臨床樣本之間具有可比性。此外，還需要更多的縱向研究，包括跨越多個大陸的更大的人群研究，以確定額外的混雜因素。事實上，幾個聯盟己在這方面做出努力，如國際人類微生物組標準(IHMS)，微生物組質控計劃(MBQC，之前推送的兩篇Nature Biotechnolog報導的DNA提取，以及實驗與分析比較均是他們的工作)己經在嘗試建立巨集基因組學標準，並確定變異的來源。

我們提出了一個可操作的腸型分類方案，它可以避開上面列出的許多問題，並可以提供更多可比較的結果(圖4)。我們並不希望限制你對資料意義的解析，但至少可以將其他方法的分析結果與按此流程分析的結果進行比較。基於MetaHIT資料集，我們建立了一個基於屬水平的線上分類器(基於HMP1和中國二型糖尿病 http://enterotypes.org/)。如果重新聚類的結果與分類器的結果不同，我們建議謹慎地將分層結果與該元分析中描述的腸型結果進行比較。
此外，這種方法還定義了腸型空間，通過確定哪些樣本與參考資料集相似，可以用來定義“正常”腸道菌群的界限，並識別出它們之外的樣本，可以作為一個健康指標。以前也報導過非正常的疾病狀態，通過使用一種包含六個物種的群落模型，在相對健康的病人中，網路分析顯示出類似三種腸型的結構為主要型別，而在脆弱的、年老的病人中，有兩個新的型別位主要型別。另一個病例報告了一種新的腸杆H，以腸桿菌科（Enterobacteriaceae）為主要類群。腸型分類器只基於現有資料，如果與已知資料不相似會排除在腸型分類之外。個體的菌群異常，通常由肥胖、NASH，高血乙醇和ROS水平引起，表明非正常的組成與消化異常有關。

圖4. 基於菌群結構鑑定腸型的技術路線
根據微生物丰度資料確定腸型的推薦流程圖。
獲取腸型分類的兩種主要途徑分別為：重鑑定（de novo identification；左側路線圖，可發現新腸型）和基於已知參考資料集的腸型分類（右側路線圖）。
依據現有模型推斷群落資料的可能結構：
(1) 先基於聚類強度引數（clustering
strength measures，附圖4）或使用DMM模型框架對資料進行評估，確定是否有叢集結構存在。其他模型也可能有助於獲取菌群資料的結構狀態，但目前這類方法的具體應用還沒有實現。
(2) 將樣品與HMP1和MetaHIT6資料進行相似性比較以確定是否為已知腸型，在http://enterotypes.org網站可實現腸型的分類和檢查。
(3) 不同的組成和結構會有許多不同的原因，例如樣品來源不同，可能來自於非西方人或嬰兒樣本，技術性問題不同，如DNA提取、引物和分析預處理偏差等。
(4) 分類器結果的一致性，可用silhouette指數來確定。

無論是用於疾病狀態識別、前瞻性分型還是解決目前存在的技術問題，標準化的腸型分類才能確保大範圍研究的可比性，並有助於我們理解腸型的作用和重要性。

結論

與人類腸道菌群結構有關的主要模式的鑑定仍然充滿挑戰性。目前可用的研究方法，每種都有各自的優點和適用範圍，鑑定出的腸型的數量和統計支援也可能會有所不同。隨著標準化流程的發展，對樣品處理和資料分析的控制，可以預期未來不同研究間結果的一致性會增加。通過新增更廣泛的樣本和背景資訊，可以進一步細化腸型的屬性，擴充套件到工業化世界之外以更好地代表全球人口的特徵。但是現在，我們在這裡提出了一種限制腸型空間的方法，以期對己知腸型之外的樣本也可進行檢測。

除了上文提到的許多困難，儘管有不同的統計支援，但多項研均究報導了具有相似菌群組成特徵的腸型。儘管腸型並非明顯的離散，且受到許多因素影響，但是它們在在分類、功能和生態特性上都有差異，並且可以在大型資料集上精確地重現。它們代表了一種獲取人類腸道中首選的微生物組成的方法，因此也可以應用於許多其他生態系統中。

僅僅依靠腸型分類可能會掩蓋潛在的重要的微生物變異，因此不能取代直接的臨床關聯分析和專業的統計分析在微生物物種和功能差異研究中的應用。然而，腸型仍與多種臨床情況有關，如從直接的疾病關聯到前瞻性分型研究，甚至是個性化的飲食干預或其他腸道菌群調節治療。儘管我們目前瞭解的知識非常有限，但我們相信腸型可以成為研究人類腸道菌群的有用工具。

腸型分類器的線上使用

你只要提交一個屬水平的OTU表文件，格式如下：

GENUS   MH0277  MH0087  MH0156
Bacteroides 0.005   0.732   0.501
Prevotella  5.359-06    0   0
Eubacterium 6.148-05    0   0.046
...         

即可獲得基於參考資料腸型分類的結果彙總如下：

同時下載可以下載每個樣品的分類詳細結果，示例如下：

ET Within_ET_space 
MH0277 ET_F FALSE  
MH0087 ET_B TRUE   
MH0156 ET_B TRUE   
MH0444 ET_B TRUE   

熱心腸日報導讀

Nature子刊：利用“腸型”對腸道菌群進行分類

原標題：腸道菌群群落組成中的腸型

① 2011年，MetaHIT團隊提出“腸型”概念，將腸道菌群分為B、P和F三類；② 這有潛在研究和臨床價值，但爭議不小，不同人根據不同試驗、演算法和分析方法，認為菌群應分為2種、4種腸型甚至是連續不可分型；③ 為統一認識和指導實踐，29位世界主流菌群科學家聯合提出新的腸型分類器及公開比對資料庫；④ 新方案充分利用和驗證HMP等資料庫，綜合考慮菌群功能、生態學及臨床需求，能更好指示出疾病和健康狀態的菌群型別；⑤ 共識仍存侷限，但意義重大。

Reference

1. Costea, P. I., et al. (2018). “Enterotypes in the landscape of gut microbial community composition.” Nat Microbiol 3(1): 8-16.
2. 注：譯文中原始文獻、資料、結果等均指提出腸型概念的原始文獻：Arumugam, R. et al. (2011). Enterotypes of the human gut microbiome. Nature, 473: 174–180.

文章譯者簡介

陳亮，博士。2010年畢業於魯東大學生物技術專業，2017年於中國科學院微生物研究所獲微生物學博士學位。目前就職於中國科學院微生物研究所病原微生物與免疫學重點實驗室，生物資訊和計算生物學研究組，任助理研究員，目前主要研究內容為微生物生態學、巨集基因組學等方面的資料探勘和分析。

劉永鑫，博士。2008年和2011年畢業東北農業大學微生物學和作物遺傳育種專業。2014年在中科院遺傳發育所獲生物資訊學博士學位，2016年博士後出站留所工作，任巨集基因組學實驗室工程師，目前主要研究方向為巨集基因組學資料分析方法、培養組學方法優化。2017年7月創辦“巨集基因組”公眾號，半年關注人數過萬，累計閱讀超百萬。

巨集基因組/微生物組是當今世界科研最熱門的研究領域之一，為加強本領域的技術交流與傳播，推動中國微生物組計劃發展，中科院青年科研人員創立“巨集基因組”公眾號，目標為打造本領域純乾貨技術及思想交流平臺。公眾號每日推送，工作日科研思路、實驗和分析技術，理論過硬實戰強；週末科普和生活專欄，輕鬆讀文看片漲姿勢。目前經過近半年發展，分享過百篇原創文章，已有12000+小夥伴在這裡一起學習了，感興趣的趕快關注吧。