FPKM\RPKM\TPM學習[轉載]

阿新 • • 發佈：2018-12-13

1.問題提出

在RNA-Seq的分析中，對基因或轉錄本的read counts數目進行標準化（normalization）是一個極其重要的步驟，因為落在一個基因區域內的read counts數目取決於基因長度和測序深度。

很容易理解，一個基因越長，測序深度越高，落在其內部的read counts數目就會相對越多。

當我們進行基因差異表達的分析時，往往是在多個樣本中比較不同基因的表達量，如果不進行資料標準化，比較結果是沒有意義的。

因此，我們需要標準化的兩個關鍵因素就是基因長度和測序深度，常常用RPKM (Reads Per Kilobase Million), FPKM (Fragments Per Kilobase Million) 和 TPM (Transcripts Per Million)作為標準化數值。

那麼，這三者計算原理是什麼，有何區別呢？

為了更清楚的展示計算過程，我們用三個樣本的4個基因的read counts矩陣做例子。

從上表，樣本3的4個基因read counts數目明顯多於其他兩個樣本，說明其測序深度較高，基因B的長度的基因A的兩倍，也使得其read counts在三個樣本中都高於A。

接下來我們要做就是對這個矩陣進行標準化，分別計算RPKM, FPKM和TPM, 請睜大你的眼睛（為了使數值可讀性更好，下面的計算中我們用10代表million）。

第一步先將測序深度標準化，計算方法很簡單，先分別計算出每個樣本的總reads數（這裡以10為單位），然後將表中資料分別除以總reads數即可，這樣就得到了reads per million. 如下表：

第二步即是基因長度的標準化了。將表2的read per million直接除以基因長度即可，如下表：

到這裡，我們即得到了RPKM。

FPKM和RPKM的定義是相同的，唯一的區別是FPKM適用於雙端測序文庫，而RPKM適用於單端測序文庫。

FPKM會將配對比對到一個片段（fragment）上的兩個reads計算一次，接下來的計算過程跟RPKM一樣。

在兩種測序中

在FPKM中，F就是指fragment，也就是說在計算時使用的是fragment而不是reads。

那麼由此可以得到在雙端測序中，如果使用RPKM計數（計數reads數目）的話，那麼RPKM值將會是FPKM值的1~2倍。（呼！我終於理解了！）

終於輪到TPM登場了。

雖然同樣是標準化測序深度和基因長度，TPM的不同在於它的處理順序是不同的。

即先考慮基因長度，再是測序深度。我們仍以表1的那個例子來說明TPM是計算過程。

第一步直接除以基因長度，得到reads per kilobase，如下表：

第二步標準化測序深度時，總的reads數要用第一步中除過基因長度的數值。

即第一樣本除以15，第二個樣本除以20.25，第三個樣本除以45.1 （別忘了我們的單位是10哦）。下表就是你們想要的TPM了。

下面，是考驗你們數學功底的時候了，有沒有看出來TPM分分鐘完虐FPKM/RPKM？其實，只要我們在表3和表5下面多加一行你就能很輕鬆地看到區別了。

我們看到每個樣本的TPM的總和是相同的，這就意味著TPM數值能體現出比對上某個基因的reads的比例，使得該數值可以直接進行樣本間的比較。

//至於為什麼每個sample的和是相通的，我也沒有搞清楚。